Uchebno-metod posobie Biokhimia i osnovy bioreg..

Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Арзамасский государственный педагогический
институт им. А.П. Гайдара»








С.А. Опарина


Биологическая химия
и основы биорегуляции организмов

Учебно-методическое пособие





















Арзамас
АГПИ
2009

УДК 577.1 (075.8)
ББК 28.073 я 73
О-60


Печатается по решению редакционно-издательского совета ГОУ ВПО «Арзамасский государственный педагогический
институт им. А.П. Гайдара»


Рецензенты:
Жильцов С.Ф., доктор химических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, зав. кафедрой органической химии НГПУ
Железнова Т.А., кандидат химических наук, зав. кафедрой химии, теории и методики обучения химии АГПИ


Опарина С.А.
О-60 Биологическая химия и основы биорегуляции организмов: Учебно-методическое пособие. - Арзамас: АГПИ, 2009. – 144 с.



Практикум полностью соответствуют учебному плану дисциплин и подробно раскрывает содержание и структуру всех семинарских и лабораторно-практических занятий. К каждому из них приведены вопросы для самоподготовки, описание лабораторных опытов и методики их проведения, система заданий, упражнений и задач для контроля и самоконтроля знаний и умений студентов.
Практикум предназначен для студентов, обучающихся по специальностям: 032400.00 - биология с дополнительной специальностью химия очной формы обучения; 032400 - биология заочной формы обучения.






© Опарина С.А., 2009.
© Арзамасский государственный педагогический институт
им. А.П. Гайдара, 2009.



Содержание Стр.

План изучения дисциплин.
5

Введение.
6

Тема 1. Аминокислоты. Белки
7

Занятие 1. Лабораторно-практическое занятие «Качественные реакции на белки. Реакции осаждения белков»

7

Занятие 2. Лабораторно-практическое занятие
«Хроматография аминокислот»

17

Занятие 3. Лабораторно-практическое занятие
«Формольный метод определения аминного азота».

24

Занятие 4. Семинар «Аминокислоты - структурные единицы макромолекул белка. Белки - важнейшие макромолекулы живого»..

28

Тема 2. Ферменты
37

Занятие 1. Лабораторно-практическое занятие «Белки – ферменты.
Физико-химические свойства ферментов».

37

Занятие 2. Семинар «Химическая природа и свойства ферментов»..
43

Занятие 3. Лабораторно-практическое занятие «Количественное
определение активности каталазы (по Баху и Опарину)»

45

Занятие 4. Семинар «Ферменты – биокатализаторы.
Классификация ферментов».

48

Тема 3. Углеводы
51

Занятие 1. Семинар «Углеводы»
51

Занятие 2. Лабораторно-практическое занятие
«Методы биохимических исследований. Рефрактометрия».

56

Тема 4. Липиды
62

Занятие 1. Семинар «Липиды»
62

Тема 5. «Витамины»
67

Занятие 1 . Семинар «Витамины»..
67

Занятие 2. Лабораторно-практическое занятие «Количественное
определение витамина С в продуктах»

70

Тема 6. Нуклеиновые кислоты..
75

Занятие 1. Семинар «Молекулярная природа генетического материала»..
75

Тема 7. Обмен нуклеиновых кислот
80

Занятие 1-2. Лабораторно-практическое занятие «Выделение ДНК»..
80

Занятие 3-4. Семинар «Механизмы передачи наследственной
информации»..

82

Тема 8. Обмен углеводов
87

Занятие 1-2. Лабораторно-практическое занятие «Углеводы.
Количественное определение углеводов по Бьерри»

87

Занятие 3-4. Лабораторно-практическое занятие «Углеводы.
Количественное определение углеводов по Бьерри» (продолжение).

91

Занятие 5-6. Семинар «Пути дыхательного обмена».
95

Занятие 7-8. Семинар «Биосинтез углеводов»..


101


Тема 9. Обмен липидов...

106

Занятие 1-2. Лабораторно-практическое занятие
«Физико – химические свойства жиров».

106

Занятие 3-4. Семинар «Обмен липидов».......
112

Тема 10. Метаболизм..
117

Занятие 1-2. Семинар «Метаболизм. Интеграция метаболизма».
117

Рекомендуемая литература...
124







































План изучения дисциплин «Биологическая химия», «Биохимия и основы биорегуляции организмов»
(VI семестр (III курс))

№ п/п
Тема занятия
Вид занятия
Кол-во
часов

1.
б/х с осн. б/р
Качественные реакции на белки. Реакции осаждения белков
лабораторно- практическое
3 ч

2.
б/х
Хроматография аминокислот
лабораторно- практическое
3 ч

3.
б/х с осн. б/р
Формольный метод определения аминного азота
лабораторно- практическое
3 ч

4.
б/х
Аминокислоты. Белки
семинар
3 ч

5.
б/х с осн. б/р
Физико-химические свойства ферментов

лабораторно- практическое
3 ч

6.
б/х
Химическая природа и свойства ферментов

семинар
2 ч

7.
б/х с осн. б/р
Количественное определение активности каталазы (по Баху и Опарину)
лабораторно- практическое
3 ч

8.
б/х с осн. б/р
Ферменты – биокатализаторы. Классификация ферментов
семинар
3 ч

9.
б/х
Углеводы

семинар
3 ч

10.
б/х с осн. б/р
Методы биохимических исследований. Рефрактометрия

лабораторно- практическое
3 ч

11.
б/х
Липиды
семинар
3 ч

12.
б/х с осн. б/р
Витамины

семинар
3 ч

13.
б/х с осн. б/р
Витамины. Количественное определение витамина С в продуктах
лабораторно- практическое
3 ч

14.
б/х с осн. б/р
Молекулярная природа генетического материала
семинар
3 ч

15.
б/х с осн. б/р
Итоговое занятие

семинар
3 ч

Итого: 44 часа


План изучения дисциплины «Биохимия и основы биорегуляции организмов»
(VII семестр (IV курс))
№ п/п
Тема занятия
Вид занятия
Кол-во
часов

1 -2.

Выделение ДНК
лабораторно- практическое
4 ч

3-4.

Механизмы передачи генетической информации
семинар
4 ч

5-6.

Углеводы. Количественное определение углеводов по Бьерри
лабораторно- практическое
4 ч

7-8.

Углеводы. Количественное определение углеводов по Бьерри (продолжение)
лабораторно- практическое
4 ч

9-10.

Пути дыхательного обмена
семинар
4 ч

11-12.

Биосинтез углеводов
семинар
4 ч

13-14.

Физико – химические свойства жиров
лабораторно- практическое
4 ч

15-16.

Обмен липидов
семинар
4 ч

17-18.

Метаболизм. Интеграция метаболизма
семинар
4 ч

Итого: 36 часов

Введение
Биологическая химия занимает ведущее место в системе высшего профессионального образования, являясь фундаментальной дисциплиной, формирующей научно-теоретическую и экспериментальную подготовку учителя биологии и химии.
В практикуме представлена система лабораторных работ по статической и динамической биохимии с применением различных методов качественного и количественного анализа. Приведен ряд методик, которые могут быть использованы в научно-исследовательской деятельности студентов, а также на занятиях школьных факультативов и спецкурсов.
Данное пособие построено с учетом внутри- и междисциплинарных связей. Оно содержит большое число заданий, упражнений и задач дифференцированного характера для самостоятельной работы студентов, позволяющих осуществлять контроль и самоконтроль за усвоением содержания основных тем.
Использование данного практикума в учебном процессе поможет более глубокому и системному усвоению студентами теоретических основ биохимии и формированию у них обобщенных экспериментальных умений и навыков, необходимых для дальнейшей профессиональной деятельности.

ТЕМА 1. АМИНОКИСЛОТЫ. БЕЛКИ

Занятие 1. Лабораторно-практическое занятие «Качественные реакции на белки. Реакции осаждения белков»
3 часа
Цель: повторить основные правила работы и техники безопасности в химической лаборатории; изучить качественные реакции на белки, обусловленные особенностями их строения; изучить реакции осаждения белков под действием различных реагентов.
Оборудование: фильтры бумажные, воронка стеклянная, набор пробирок стеклянных химических, водяная баня.
Реактивы: растворы белков, уксусная кислота (1%-ная и 10%-ная), хлорид натрия, гидроксид натрия (10%-ный), азотная, соляная, серная и уксусная кислоты (конц.), трихлоруксусная кислота (5%-ная), сульфосалициловая кислота (20%-ная), сульфат меди (5%-ный), ацетат свинца (5%-ный), соляная кислота (5%-ная), этиловый спирт, нитропруссид натрия (5%-ный), 1%-ный нингидрин в 95%-ном растворе ацетона, гидроксид аммония (конц.).

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.34-52., С.52-72.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.170-172, С.173-182.
Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 - С.107-133, С.137-161.
Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1. – С.-21-33, С.-42-50.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.9-15, С.16-30.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания техники безопасности при работе с химическими реактивами и правила оказания первой медицинской помощи; знания состава и свойств белков, механизмов осаждения и высаливания белков, основных денатурирующих факторов; умения по вычислению заряда аминокислот в различных средах, суммарного заряда пептидов и белков. При выполнении лабораторного практикума необходимы знания общих качественных реакций на протеиногенные аминокислоты и характерных цветных реакций на отдельные аминокислоты, входящие в состав белков; знания механизмов реакций осаждения белков.
Для лучшего усвоения материала при оформлении работы цветные реакции на белки необходимо сопровождать рисунками с наблюдаемыми в пробирках внешними признаками реакций. В конце работы формулируется вывод.

План занятия
I. Теоретический практикум.
Лабораторный практикум.
I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
1. Техника лабораторных работ. Порядок работы в лаборатории. Общие положения.
2. Обязательные требования к технике безопасности при работе студентов в химической лаборатории.
3. Правила оказания первой медицинской помощи.
3. Классификация аминокислот.
4. Общая характеристика и свойства аминокислот.
5.Физико-химические свойства белков.
6. Физические и химические факторы, вызывающие денатурацию белка.
7. Процессы, лежащие в основе денатурации и высаливания белков.

II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Часть 1. Качественные реакции на белки
Приготовление растворов белков для проведения качественных реакций.
А) Приготовление неразбавленного белка куриного яйца.
Б) Приготовление разбавленного раствора куриного альбумина.
Качественные реакции на белки.
1. Биуретова реакция (обнаружение в молекулах белков пептидных связей).
2. Нингидриновая реакция ( на обнаружение
·-аминокислот).
3. Ксантопротеиновая реакция.
4. Реакция Вуазене.
Реакция Паули.
6.Реакция на «слабосвязанную серу».
7. Реакция Адамкевича.
8. Нитропруссидная реакция.

Часть 2. Реакции осаждения белков
Осаждение белков спиртом.
Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.
Осаждение белков органическими кислотами.
Свертывание белков при нагревании.
Осаждение белков солями тяжелых металлов.
Осаждение белков фенолом и формалином.
Высаливание белков сульфатом аммония.

Часть 1. Качественные реакции на белки

Приготовление растворов белков для проведения
качественных реакций
А) Приготовление неразбавленного белка куриного яйца
Отделяют белок трех куриных яиц от желтков. Считая, что масса белка в одном яйце в среднем равна 33г, получают около 100 мл неразбавленного раствора белков куриного яйца. Этот раствор содержит 88% воды, 1 % углеводов и 0,5% минеральных веществ; остальное приходится на белок. Таким образом, полученный неразбавленный белок куриного яйца представляет собой примерно 10%-ный раствор белка.
Б) Приготовление разбавленного раствора куриного альбумина
Белок одного куриного яйца после отделения от желтка хорошо взбивают и затем смешивают в колбе при встряхивании с десятикратным объемом дистиллированной воды. Раствор фильтруют через двойной слой смоченной водой марли или кусок стираного полотна, помещенного в воронку. Отфильтровывают раствор яичного альбумина; в осадке остается яичный глобулин. Учитывая, что концентрация альбумина в белке куриного яйца составляет около 6%, полученный разбавленный раствор яичного альбумина является примерно 0,5%-ным.
II. Качественные реакции на белки

1. Биуретова реакция
(обнаружение в молекулах белков пептидных связей)
К 12 мл разбавленного белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия, хорошо перемешивают и добавляют 23 капли 1%-ного раствора сульфата меди (II). Снова тщательно перемешивают. Развивается красно-фиолетовое окрашивание. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.
Свое название реакция получила от биурета – соединения, которое образуется при нагревании мочевины. Эта реакция сопровождается выделением аммиака:

Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

При взаимодействии биурета с раствором сульфата меди (II) образуется биуретовый медный комплекс. Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют внутрикомлексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота аминных групп:


Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами любых полипептидов:

R1, R2, R3 , R4 - остатки аминокислот

2. Нингидриновая реакция (обнаружение
·-аминокислот)
К 23 мл неразбавленного раствора белка приливают 34 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.
Сущность реакции заключается в том, что
·-аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию:

Восстановленный нингидрин взаимодействует с аммиаком и второй молекулой нингидрина, в результате чего образуется окрашенное соединение (пурпурный Руэманна), по имени исследователя, впервые в 1910 г. изучившего эту реакцию:

В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их массы.

3. Ксантопротеиновая реакция
К 1 мл раствора белка добавляют 56 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к раствору, имеющему кислую реакцию, не взбалтывая, по каплям избыток концентрированного гидроксида аммония или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет. Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана). Реакцию следует проводить под тягой!
Реакция протекает в две стадии. На первой аминокислота, например, тирозин, взаимодействуя с концентрированной азотной кислотой, подвергается нитрованию. При этом образуется динитротирозин (желтого цвета).

На второй стадии продукты нитрования тирозина реагируют с гидроксидом натрия или гидроксидом аммония с образованием натриевой или аммонийной соли (хромофорных групп), имеющей желто-оранжевое окрашивание.


4. Реакция Вуазене
К 2 мл неразбавленного раствора белка в пробирке добавляют одну каплю 2,5%-ного раствора формальдегида. Смешивают и прибавляют 6мл чистой концентрированной соляной кислоты (плотность не менее 1,175), после чего снова перемешивают (можно поставить на водяную баню). Через 10 мин прибавляют при взбалтывании 10 капель 0,5%-ного раствора нитрита натрия. Развивается интенсивное сине-фиолетовое окрашивание. Реакция протекает только с теми белками, которые содержат в своем составе триптофан.

5. Реакция Паули
К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6мл 10%-ного раствора карбоната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание. Возникновение окраски обусловлено наличием в белковой молекуле остатков гистидина и тирозина.

6. Реакция на «слабосвязанную серу»
В пробирку наливают 0,51,0 мл неразбавленного белка, добавляют двойной объем концентрированного раствора щелочи, кладут несколько «кипятильников» и кипятят смесь (осторожно, жидкость может выбросить!). При этом выделяется аммиак, который может быть обнаружен по запаху и по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки!). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипячении.
Горячую щелочную жидкость делят на 2 части:
- к первой приливают раствор плюмбита натрия, образуется желто-бурое или черное окрашивание. Плюмбит натрия получается при смешивании растворов растворимых солей свинца (Pb(CH3COO)2 или Pb(NO3)2) с избытком NaOH. Сначала при постепенном прибавлении NaOH выпадает осадок, который при дальнейшем приливании NaOH растворяется.
- ко второй добавляют 2-3 капли свежеприготовленного разбавленного раствора нитропруссида натрия, получается красно-фиолетовое окрашивание.
При наличии в молекуле белка аминокислот, содержащих серу (цистина, цистеина), от этих аминокислот постепенно отщепляется также и сера в виде иона в степени окисления +2. Его образование можно обнаружить с помощью ионов тяжелых металлов, например ионов свинца, образующих с ионами серы черный нерастворимый сульфид свинца: Pb2+ + S2- PbS

7. Реакция Адамкевича
Наливают в пробирку несколько капель неразбавленного белка и прибавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты, к которой добавляют немного глиоксиловой кислоты. Смесь слегка нагревают до растворения образующегося осадка. Охлаждают пробирку со смесью, а затем, сильно наклонив ее, осторожно, по стенке приливают 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы обе жидкости не смешались. При стоянии на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовое кольцо.
Желатин не дает этой реакции, так как она не содержит аминокислоты триптофана, от присутствия которого зависит эта реакция. Окраска возникает за счет реакции триптофана с глиоксиловой кислотой, всегда присутствующей в уксусной кислоте в виде примеси. Небольшие количества меди повышают чувствительность реакции.

8. Нитропруссидная реакция
В пробирку берут 3 мл разбавленного раствора белка, приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и 23 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями крепкого раствора аммиака. Если в белке присутствует цистеин, то происходит реакция, в результате которой развивается пурпурное окрашивание.

Часть 2. Реакции осаждения белков
Основной теоретический материал
В состав белков входят разнообразные аминокислотные радикалы, поэтому белки вступают во взаимодействие со многими соединениями (кислотами, ионами металлов, спиртами и т. п.), а также конкурируют с ними за молекулы растворителя (воды). Во многих случаях результатом указанных процессов является выпадение белков в осадок.
Реакции осаждения делят на два вида:
Высаливание белков сульфатом аммония (NH4)2SO4, при котором снимается только гидратная оболочка, белок сохраняет все виды своей структуры, все связи, сохраняет нативные свойства. Такие белки можно затем вновь растворить и использовать.
В водном растворе белков их частицы заряжены и гидратированы, что обусловливает устойчивость белковых растворов. Но при высокой концентрации солей, ионы которых тоже гидратированы, происходит разрушение водных оболочек белковых молекул и снимается заряд с белковой молекулы адсорбирующимися на ней ионами соли. В результате этих двух процессов белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются друг с другом, укрупняются и, наконец, выпадают в осадок.
Сульфат аммония обладает резко выраженной высаливающей способностью и осаждает белки в нейтральной среде, а еще лучше в слабокислой среде. Другие соли, например, хлорид натрия, вызывают полное осаждение бельков только при подкислении раствора белка. Для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей. Следовательно, белки можно высаливать фракционно: глобулины выпадают уже при полунасыщении растворов сульфатом аммония, а альбумины выпадают только при полном насыщении.
Осаждение с потерей нативных свойств белка - процесс необратимый. С белка снимается гидратная оболочка и заряд, нарушаются различные свойства в белке. Например, соли [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]
Rf является характерной величиной для каждого вещества (в т.ч. и для каждой аминокислоты) и постоянен при данных условиях опыта.

В соответствии с направлением движения растворителя различают:
Восходящую хроматографию, когда растворитель движется снизу вверх, благодаря силам капиллярности.
Нисходящую хроматографию, когда растворитель движется сверху вниз под влиянием сил тяжести и капиллярных сил.
Горизонтальную иди круговую хроматографию.

Современные методы хроматографии
Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) - вид [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], в которой подвижной фазой служит [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], а неподвижной - [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], нанесенная тонким слоем ([ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]100 нм) на твердый [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ].. Неподвижная жидкая фаза должна быть термически стабильной, химически устойчивой, иметь небольшую [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]. В качестве ее используют дигидроксидипропионитрил, диглицерол, сквалан, три-n-крезилфосфат и др. Особую селективность проявляют комплексообразующие неподвижные жидкие фазы, например раствор [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] Ag(I) в [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], который позволяет разделять непредельные соединения, в т. ч. их цис-и транс-изомеры. Термически стойки и селективны [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] (устойчивы до 225 °С), полидиметилсилоксан (до 350 °С) и др. Слой [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] на твердом [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] служит для улучшения [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] разделяемых соединений между подвижной и неподвижной фазами. В качествеве [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] используют специально обработанные для снижения адсорбционной [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] материалы на основе [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] (полихромы), неорганические [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] (хлориды, сульфаты) и др.
Афинная хроматография. Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой – связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом. Наиболее часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание (рис.1).
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ][ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Рис.1. Механизм аффинной хроматографии
Гель-фильтрационная, или молекулярно-ситовая, хроматография. Неподвижной фазой являются материалы, обычно гели, со строго контролируемой пористостью, в результате чего одни компоненты смеси в соответствии с размером и формой молекул могут проникать между частицами геля, а другие не могут. Наиболее часто этот вид хроматографии используется для разделения высокомолекулярных соединений. Один из вариантов применения этого метода – определение молекулярных масс разделяемых веществ, часто необходимых для химических исследований (рис. 2).
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]



Рис. 2. Схема разделения смеси методом гель-хроматографии:
а – начало разделения; б – разделение; в – конец разделения;
большие кружки – частицы геля, большие точки – молекулы соединений с большой Мr, маленькие точки – молекулы соединений с меньшей Мr.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) основана на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое (толщина 0,1-0,5 мм) сорбента при их движении в потоке подвижной фазы (элюента). Последняя представляет собой, как правило, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], однако осуществлен и газовый вариант ТСХ. В качестве сорбентов используют мелкозернистые [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], Аl2О3, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] и др. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] этих сорбентов покрывают пластинки из стекла, фольги или [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]; для закрепления слоя применяют [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] или др. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]. Промышленностью выпускаются готовые пластинки с уже закрепленным слоем сорбента. Элюентами служат обычно смеси органических растворителей, водных растворов кислот, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], комплексообразующих и др. веществ. В зависимости от выбора хроматографической системы (состава подвижной и неподвижной фаз) в разделении веществ основную роль могут играть процессы [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], экстракции, [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], комплексообразования. На рис. 3 представлена камера для тонкослойной хроматографии.

[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
Рис. 3. Камера для тонкослойной хроматографии:
а – общий вид; б – схематичный разрез: 1 – подложка со слоем сорбента;
2 – край камеры; 3 – емкость для растворителя.

Области применения хроматографии
Индентификация веществ и установление различия между ними.
Разделение сложной смеси на отдельные компоненты с препаративными целями.
Испытание вещества на однородность, на чистоту.
Очистка веществ от примесей.
Концентрирование вещества и его выделение из разбавленных растворов или смесей.
Контроль и автоматизация производственных процессов.

Основные преимущества метода хроматографии:
Разделяемые вещества не подвергаются химическим изменениям;
Отличается большой чувствительностью, то есть требует ничтожно малых количеств вещества для анализа;
Возможность разделять вещества, с трудом поддающиеся разделению другими методами;
Отличается простотой процедур, несложностью и экономичностью аппаратуры, малой затратой времени.

II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Основной теоретический материал
Качественное определение аминокислот можно проводить, сравнивая месторасположения неизвестных аминокислот с пятнами известных аминокислот (метод «свидетеля»).
Высушиванием аминокислоты фиксируются на хроматографической бумаге и затем с нингидрином дают соответствующее окрашивание. Бумажные полоски с фиксированными и окрашенными аминокислотами называют хроматограммами. Сине-фиолетовая окраска пятен аминокислот довольно быстро (в течение нескольких дней) разрушается. Чтобы избежать обесцвечивания пятен на хроматограмме, ее обрабатывают из пульверизатора насыщенным раствором нитрата меди в 90% растворе ацетона.

Ход работы
Из листа хроматографической бумаги вырезается заготовка хроматограммы размером 5x8 см. Обратите внимание на то, чтобы заготовка хроматограммы имела поперечное расположение волокон на бумаге. При продольном расположении волокон на бумаге пятна на хроматограмме получаются размытыми и имеют «хвосты».
На конце заготовки сделать прокол иглой, продеть в прокол нитку и завязать ее петлей.
В склянку налить смесь бутанола, уксусной кислоты, воды (15:3:7) так, чтобы было покрыто дно.
На конце заготовки хроматограммы делают простым карандашом 4 точки на равном расстоянии друг от друга и от краев.
Наносят в 3 точки раствор аминокислот - «свидетелей», а в 4 точку - раствор смеси неизвестных аминокислот.
Подсушить хроматограмму на воздухе.
Опустить хроматограмму в склянку до соприкосновения нижнего края со смесью. Придерживая нитку, закрыть склянку пробкой так, чтобы полоска висела на нитке, касаясь смеси.
Через 1-1,5 часа как фронт растворителя поднимется доверху, вынуть полоску и подвесить ее за нитку в сушильный шкаф.
Сухую полоску смочить 0,5 проц. раствором нингидрина с помощью пульверизатора.
Подсушить полоску.
Определить неизвестные аминокислоты по «свидетелям».
Рассчитать для всех аминокислот.
Закрепить окраску хроматограммы, обработав ее из пульверизатора насыщенным раствором нитрата меди в ацетоне.
Вопросы для самопроверки
Охарактеризуйте хроматографический метод анализа.
Кем и когда был открыт хроматографический метод? Получил ли он распространение в те годы?
Назовите области применения хроматографии.
Почему хроматографический анализ в настоящее время является незаменимым в биологических исследованиях.
Какие виды хроматографии вы знаете? Дайте им характеристику. На чем основана такая классификация?
Какой наиболее распространенный вид хроматографии в биологии? Дайте ему характеристику.
Что такое коэффициент распределения? Как его можно определить?
Какие виды хроматографии различают в бумажной хроматографии? Дать им характеристику.
Каким способом можно обеспечить длительное сохранение хроматограммы аминокислот?
Охарактеризуйте методы хроматографического анализа, возникшие в последние годы (тонкослойная хроматография, афинная хроматография, газо-жидкостная хроматография).
Когда и кем был переоткрыт этот метод?



Занятие 3. Лабораторно-практическое занятие
«Формольный метод определения аминного азота»
3 часа
Цель: экспериментально определить содержание аминного азота в белках методом формольного титрования.
Оборудование: технические весы, электроплитка, воронки, пипетки на 20 и 10 мл, фарфоровые ступки, конические колбы на 100 мл, бумажные фильтры, стеклянные палочки, ножницы, бюретки, мерные колбы на 50 мл, толченое стекло.
Реактивы: 0,2н раствор гидроксида натрия, 0,2н раствор хлороводородной кислоты, формольная смесь (50мл 30-40 проц. Формалина + 1 мл 0,1 проц. спиртового раствора фенолфталеина, смесь доводят 0,2н раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания).
Материалы: темновые и световые проростки бобовых растений, непроросшие семена тех же растений.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
1.Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.34-52.
2.Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.170-172.
3.Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 - С.107-133.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.-21-33.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, "Медицина", 2007.- С.9-15.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания основного теоретического материала о классификации и особенностях строения, физико-химических свойств белков; умения по записыванию уравнений реакций, лежащих в основе данной работы, расстановке коэффициентов в ОВР методом полуреакций. При выполнении лабораторного практикума необходимы знания о сущности и особенностях кислотно-основного метода титрометрического анализа.

План занятия
Теоретический практикум.
II. Лабораторный практикум.
I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
1. Сущность и особенности метода нейтрализации.
2. Классификация белков.
3. Физико-химические свойства белков.
4. Уравнения реакций, лежащих в основе работы.

Основной теоретический материал
Сущность и характеристика метода нейтрализации
В основе кислотно-основного метода титрования лежит реакция нейтрализации:
Н+ + ОН- Н2О
Н3О+ + ОН- 2 Н2О
Этим методом можно определить количество кислот, оснований и гидролизующихся солей. При протекании реакции нейтрализации не наблюдается каких-либо видимых эффектов. Поэтому для фиксирования точки эквивалентности применяют индикаторы.
Индикаторы метода нейтрализации, или рН-индикаторы, изменяют свою окраску внутри определенного узкого интервала значений рН. Интервал этот зависит только от свойств данного рН-индикатора и совершенно не зависит от природы реагирующих между собой кислот и оснований. Важной характеристикой индикатора является его константа ионизации и найденный по ее величине силовой показатель рК = -lg К (показатель индикатора), по величине которого находят тот интервал значений рН, в котором индикатор изменяет свою окраску, или интервал перехода окраски индикатора: рН = рК ± 1.
Зная константу, по этой формуле можно вычислить интервал перехода любого индикатора. Для фенолфталеина К=10-9, рН = рК ± 1 = -lg 10-9± 1 = 9 ± 1, т.е. 8-10.
То значение рН, при котором резко изменяется окраска индикатора и заканчивается титрование, называется показателем данного индикатора (рТ).
Величина показателя титрования находится приблизительно в середине интервала перехода и имеет значение, близкое к рК. Показатель титрования фенолфталеина рТ рК = -lg 10-9 = 9.
Для правильного выбора индикатора строят кривые титрования, которые являются графическим изображением изменений рН раствора в процессе титрования и в точке эквивалентности.
Существует правило выбора индикатора: для каждого данного титрования можно применять только те индикаторы, показатели титрования которых лежат в пределах скачка рН на кривой титрования. Показатель титрования рТ индикатора должен быть возможно ближе к тому рН, который характеризует точку эквивалентности титрования. Величина рН в точке эквивалентности зависит от силы электролитов, учавствующих в реакции нейтрализации.
При титровании сильной кислоты сильной щелочью (или наоборот) получается раствор нейтральной негидролизующейся соли, имеющей в точке эквивалентности рН 7.
При титровании слабой кислоты сильным основанием образуется соль, которая в растворе гидролизуется по аниону, в точке эквивалентности рН 7, среда щелочная.
При титровании слабого основания сильной кислотой образуется соль, которая в растворе гидролизуется по катиону, в точке эквивалентности рН 7, среда кислая.
Для правильного выбора индикатора необходимо:
составить уравнение реакции;
вычислить рН раствора в точке эквивалентности;
подобрать индикатор, величина рТ которого равна величине рН в точке эквивалентности.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
В процессе расщепления белков кислотами или ферментами образуются аминокислоты, которые содержат свободные аминогруппы и карбоксильные группы. Чтобы определить количество аминогрупп, их блокируют формальдегидом, а оставшиеся свободные карбоксильные группы оттитровывают щелочью. По количеству пошедшей на титрование щелочи определяют количество –СООН-групп. При этом учитывают, что в среднем число карбоксильных групп в аминокислотах белков равно числу аминогрупп.
В начале аминные группы аминокислот вступают в реакцию с формальдегидом с образованием метиленовых соединений (метилен- аминокислот):

Метиленаминокислоты обладают более сильными кислотными свойствами, чем аминокислоты, и легко оттитровываются щелочью:

Достоинством метода формольного титрования являются быстрота и удобство определения.
Ход работы
Растирают в ступке 5г проростков или семян с 5-10 мл дистиллированной воды и с толченым стеклом. Содержимое ступки количественно переносят в мерную колбу на 50мл, промывными водами доводят до метки, перемешивают и фильтруют, в фильтрате определяют аминный азот.
Для опыта берут 20мл фильтрата, приливают 10мл формольной смеси и из бюретки 0,2н раствор щелочи до появления яркого окрашивания. Избыток щелочи оттритровывают 0,2н раствором хлороводородной кислоты до бледно-розовой окраски.
Одновременно проводят контрольное титрование. Для этого к 20мл прокипяченной и охлажденной воды приливают 10мл формольной смеси и избыток 0,2н раствора щелочи из бюретки. Затем соляной кислотой раствор доводят до слабо-розовой окраски. Расчет производят по следующей формуле:

13 EMBED Equation.3 1415, где
Nщ - нормальная концентрация щелочи,
Vощ - объем щелочи, добавленной в избытке к 20 мл опытного фильтрата,
Vкщ - объем щелочи, добавленной в избытке к 20 мл контрольной пробы,
Nк - нормальная концентрация кислоты,
Vкобъем кислоты, пошедшей на титрование избытка щелочи, добавленной к 20 мл опытного фильтрата,
Vкк - объем кислоты, пошедшей на титрование избытка щелочи, добавленной к 20 мл контрольной пробы,
ЭN - эквивалент азота (он равен 14),
Vк - общий объем вытяжки (колбы),
Vп - объем вытяжки, взятой на титрование (пипетки),
m - масса навески растительного материала.


Вопросы для самопроверки
На чем основано определение аминного азота формольным методом?
Напишите уравнения реакций, лежащих в основе определения содержания аминного азота формольным титрованием.
Почему формальдегид, применяющийся при определении аминного азота, нужно предварительно нейтрализовать?
К какому методу анализа (нейтрализации, редоксиметрии, гравиметрии и т. д.) относится формольный метод определения аминного азота?
Какой титрованный раствор является рабочим при формольном определении аминного азота?
С какой целью проводят контрольное титрование?
Какой метод и способ титрования применяется при выполнении данной работы?



Занятие 4. Семинар «Аминокислоты - структурные единицы
макромолекул белка. Белки - важнейшие макромолекулы живого»
3 часа
Цель: изучить особенности строения, свойств и характерных реакций метаболизма аминокислот и белков; сформировать умения по вычислению суммарных зарядов полипептидов и определению их поведения в электрическом поле.
Основная литература:
1.Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.34-72.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.170-182.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1- С.107-269.
Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.21-51.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, "Медицина", 2007.- С.9-15,С.16-55.



Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания формул, особенностей строения и свойств аминокислот, их классификации, метаболизма, обратить внимание на реакции, лежащие в основе орнитинового цикла и его значение. Также требуется систематизировать материал о строении, классификации, уровнях структурной организации и классификации белков. Необходимы умения по вычислению заряда аминокислот в различных средах, суммарного заряда пептидов и белков, записи уравнений реакций аминокислот.

План занятия
I. Теоретический практикум.
II. Решение задач.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Основные вопросы для семинара
Общие свойства и строение аминокислот и их изомеры.
Цвитерион. Амфотерные свойства аминокислот.
Классификация аминокислот. Характеристика отдельных групп аминокислот.
Превращение аминокислот: по аминогруппе (реакции дезаминирования, переаминирования); по карбоксильной группе (реакции декарбоксилирования); по радикалу.
Конечные продукты распада аминокислот. Пути обезвреживания аммиака в организме. Орнитиновый цикл.
Историческая справка об открытии белков, изучении их строения, свойств, биологической значимости.
Полипептидная теория строения белковой молекулы.
Белки, как амфотерные электролиты. Физико - химическая характеристика белков (М. форма, размер, заряд, ИЭТ, денатурация и т.д.).
9. Уровни структурной организации белков. 10.Функциональное разнообразие белков.
11. Классификация белков.
12.Изучение темы «Аминокислоты. Белки» в школьном курсе биологии.

Частные вопросы к теоретическому практикуму по теме «Аминокислоты»
Общие структурные свойства и строение аминокислот.
Что называется боковой цепью или радикалом аминокислоты?
Что такое цвиттерион?
При каких значениях рН аминокислоты в растворах находятся в виде цвиттерионов?
Почему аминокислоты обладают амфотерными свойствами?
При каких значениях рН моноаминомонокарбоновые аминокислоты находятся в виде катиона?
При каких значениях рН моноаминомонокарбоновые аминокислоты находятся в виде аниона?
Что такое ИЭТ?
Чем объясняются основные свойства лизина и кислые свойства аспарагиновой кислоты?
В какой области значений рН и почему находится ИЭТ: а) кислой б) нейтральной в) основной аминокислоты?
В каком направлении (к катоду или аноду) передвигается аланин при рН > ИЭТ; рН < ИЭТ; рН = 7?
Сколько стереоизомеров может иметь аминокислота?
Есть ли стереоизомеры у глицина?
L- и D- изомеры аминокислот. Проекционные формулы аминокислот.
Какие изомеры аминокислот входят в состав белка?
Общие свойства аминокислот (агрегатное состояние, цвет, растворимость, отношение к нагреванию, оптические свойства).
Назвать аминокислоты, содержащие полярные незаряженные радикалы.
Назвать аминокислоты, содержащие неполярные (гидрофобные) радикалы.
Назвать аминокислоты, содержащие отрицательно заряженные радикалы.
Назвать аминокислоты, содержащие положительно заряженные радикалы.
Что такое протеиногенные аминокислоты?
Заменимые и незаменимые аминокислоты.
Перечислить основные незаменимые аминокислоты.
Аминокислоты, не входящие в состав белка - биологически важные соединения.
Какое число свободных аминокислот выделено из природных источников.
Какие аминокислоты (заменимые или незаменимые) эволюционно более молодые.
Классификация аминокислот.
Характеристика и представители моноаминомоно-карбоновых кислот.
Характеристика и. представители оксиаминокислот.
Характеристика и представители серосодержащих аминокислот.
Характеристика и представители моноаминодикарбоновых кислот.
Характеристика и представители диаминомонокарбоновых кислот.
Характеристика и представители циклических аминокислот.
Превращения аминокислот: реакции по аминогруппе (реакции дезаминирования и переаминирования).
Реакции по карбоксильной группе.
Превращения аминокислот по радикалу.
Какие реакции по аминогруппе наиболее распространены в природе?
Новообразование аминокислот (прямое аминирование непредельных кислот, восстановительное аминирование).
Образование аминов в процессе жизнедеятельности, их биологическое значение.
Из каких аминокислот в результате разнообразных превращений образуются биологически важные, обладающие сильным физиологическим действием, следующие соединения; гормон адреналин, витамин РР, индолилуксусная кислота (ИУК), аргининфосфат и т.п. Указать физиологическое действие названных соединений.
Какова судьба конечных продуктов распада аминокислот.
Схема образования конечного продукта аминокислотного обмена у животных и человека - мочевины (орнитиновый цикл).
Другие пути обезвреживания аммиака в растительных и животных клетках.
Отличия между растительными и животными организмами по способности синтезировать аминокислоты.

Частные вопросы к теоретическому практикуму по теме «Белки»
Историческая справка об открытии белков, изучении их строения, свойств, биологической значимости. Роль русских и советских ученых.
Белки - важнейшие макромолекулы организма.
Разнообразие белков и их функции.
Качественный и количеств0нный аминокислотный состав белков.
Элементарный состав белков, пептидная теория строения.
Принципиальное различие между аминокислотами, постоянно встречающимися и иногда встречающимися (минорными) в белках.
Что такое пептиды?
В чем отличие пептида от белка?
Природные биологически активные пептиды (глутатион, окситоцин, вазопрессин и др.).
Белки как амфотерные электролиты.
Физико-химические характеристики белков (молекулярная масса, форма, размер, получение в кристаллической форме, заряд молекулы белка в нейтральной среде, ИЭТ, буферное действие, оптическая активность).
Какие аминокислоты (кислые, основные, нейтральные) преобладают в составе пептида, если ИЭТ лежит в слабокислой среде?
Как рассчитать коэффициент поликонденсации аминокислот (количество аминокислот) в белковой молекуле, если известна молекулярная масса белка?
Все ли белки имеют полный набор аминокислот?
Каковы доказательства полипептидной теории строения белковой молекулы?
Каково тонкое строение пептидной связи?
Что понимают под первичной структурой белка?
В чем выражается видовая специфичность первичной структуры инсулина и вариации первичной структуры нормального и аномального гемоглобина человека?
Вторичная ступень организации белковой молекулы. Характеристика
·-спирали и
·-складчатой структуры.
Каковы основные параметры
·-спирали?
Что представляет собой
·-структура полипептидной цепи?
Назвать гpyппу
·-спиралеобразуюших аминокислот.
Назвать аминокислоты, способствующие образованию
·-слоев полипептидной цепи?
Третичная структура организации макромолекулы белка, связи, ее стабилизирующие.
Четвертичная ступень организации макромолекулы, связи, ее стабилизирующие.
Работы Полинга, Кендрью, Перутца по установлению вторичной и третичной структуры белка.
Что такое мультимерный и олигомерный белок? Принципиальное различие между ними.
Биологическое значение мультимеров.
Номенклатура пептидов.
Классификация белков: а) по форме молекул, б) по наличию или отсутствию небелкового компонента, в) по аминокислотному составу, г) по структурной организации белка, д) в соответствии с выполняемыми функциями.
Характеристика хромопротеинов.
Характеристика нуклепротеинов.
Характеристика гликопротеинов.
Характеристика липопротеинов.
Характеристика фосфопротиинов.
Характеристика металлопротеинов.
Характеристика простых белков.
Растворимость белка в разных растворителях в зависимости от содержания полярных и неполярных аминокислот.
Почему
·-спираль правозакрученная?
Что можно сказать об аминокислотной последовательности гомологичных белков у филогенетически близких и дальних видов?
Что является движущей силой при возникновении и структур в белковой молекуле?
Почему возникают в одних случаях
·-спиральные участки, в других -
·-структурные?
Что является движущей силой образования третичной структуры?
Что оказывает влияние на конформацию белковой глобулы?
Каков критический предел молекулярной массы белковой молекулы, обладающей четвертичной структурой?
От чего зависит биологическая активность белка?


II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
Мышечный белок тропомиозин представляет собой суперспираль, состоящую из двух
·-спирализованных тяжей. Масса этого белка - 70 кДа. Средняя масса одного аминокислотного остатка около 110 Да. Рассчитайте длину молекулы.
Объем эритроцита в среднем составляет 87 куб.мкм. Концентрация гемоглобина в эритроцитах в среднем 34г/100 мл.
а) Сколько по весу гемоглобина содержится в одном эритроците?
б) Сколько молекул гемоглобина содержится в одном эритроците?
Сколько железа содержится в гемоглобине человека весом 70кг? Примем, что объем крови составляет 70 мл/кг и содержание гемоглобина в крови 16 г/100 мл.
Миоглобин кашалота имеет следующий аминокислотный состав:

аланин
5
глутамин
5
лейцин
18
серии
6

аргинин
4
глутамино вая кислота
14
треонин
5
глицин
11

аспарагин
2
лизин
19
метионин
2
триптофан
2

аспараги- новая кислота
6
гистидин
12
фенилаланин
6
тирозин
3

цистеин
0
изолейцин
9
пролин
4
валин
8


а) Определите общий заряд ферромиоглобина при рН 2, 7 и 9.
б) Определите изоэлектрическую точку миоглобина.
Состояние ионизации аминокислот. Каждая ионизируемая группа аминокислоты может находиться в одном из двух состояний - заряженном или нейтральном. Нарисуйте ионные структуры гистидина, преобладающие при рН 1, 4,'8 и 12. Куда будет двигаться гистидин при каждом из этих значений рН в ходе электрофорезак аноду (+) или катоду ()?
Электрофорез аминокислот на бумаге. Каплю раствора, содержащего смесь глицина, аланина, глутаминовой кислоты, лизина, аргинина и гистидина, нанесли на середину полоски бумаги и дали ей высохнуть. Затем бумагу смочили буфером с рН 6,0 и к концам полоски приложили электрическое напряжение.
а) Какая аминокислота будет двигаться к аноду?
б) Какая аминокислота будет двигаться к катоду?
в) Какая аминокислота останется на стартовой точке или вблизи нее?
Обозначение оптических изомеров изолейцина.
а) Сколько хиральных центров имеет молекула изолейцина?
б) Сколько оптических изомеров может быть у изолейцина?
в) Нарисуйте перспективные формулы всех оптических изомеров изолейцина?
Растворимость: высаливание.
а) Чистые белки большей частью нерастворимы в дистиллированной воде, но растворяются в разбавленных солевых растворах. Однако при добавлении к водному раствору белка нейтральных солей в высокой концентрации белок выпадает в осадок. Это явление называют высаливанием. Например, большая часть белков растворяется в 0,1М сульфата аммония, но выпадает в осадок, если концентрация сульфата аммония повышается до 3М. После удаления избытка сульфата аммония путем диализа белки снова растворяются. Попытайтесь объяснить на молекулярном уровне, почему добавление солей в высоких концентрациях приводит к понижению растворимости белка.
Ранние данные о структуре шерсти.
Уильям Астбери первым заметил, что рентгенограмма шерсти указывает на присутствие структурной единицы, повторяющейся вдоль волокна с интервалом около 0,54нм. После растяжения шерсти, подвергнутой действию пара, на рентгенограмме появлялись признаки изменения периодичности структуры: новая структурная единица повторялась через каждые 0,70нм. После того как обработанная паром шерсть укорачивалась, на рентгенограмме снова возникала периодичность около 0,54нм. Хотя эти наблюдения послужили ключом к пониманию молекулярной структуры шерсти, Астбери не смог в то время их интерпретировать. Исходя из современных данных о структуре шерсти, объясните эти наблюдения.
Скорость синтеза
·-кератина волос.
По нашим меркам волос растет относительно медленно - со скоростью 15-20см в год. Зона роста находится у основания волоса, где в клетках эпидермиса синтезируются

·-кератиновые нити, скручивающиеся затем наподоБие канатов. Основным структурным элементом
·-кератина является
·-спираль, шаг которой составляет 0,54нм, а на виток приходится 3,6 аминокислотных остатков. В предположении, что фактором, лимитирующим рост волос, служит биосинтез
·-спиральных цепей кератина, рассчитайте скорость образования пептидных связей в цепях
·-кератина (число пептидных связей в 1 сек.), которая могла бы обеспечить наблюдаемое удлинение волос за 1 год.
Почему шерсть садится?
Если шерстяной свитер или шерстяные носки постирать в горячей воде, а затем высушить в электросушилке, они становятся меньше. Исходя из того, что известно о структуре
·-кератина, как объяснить это явление? Вместе с тем шелк при тех же условиях не дает такой усадки. Объясните, почему.
Устойчивость цистинсодержащих белков к нагреванию.
Большинство глобулярных белков при кратковременном нагревании до 650С денатурирует (претерпевает процесс разворачивания цепей) с полной потерей активности. Однако те глобулярные белки, в которых содержится много остатков цистина, денатурируют только при более длительном нагревании до более высоких температур. Одним из таких белков является рибонуклеаза, содержащая 124 аминокислотных остатка в единственной полипептидной цепи, в которой имеется четыре поперечные дисульфидные связи, образованные остатками цистина. Чтобы полипептидная цепь рибонуклеазы развернулась, необходимо нагреть содержащий ее раствор до высокой температуры; если затем быстро охладить его, то ферментативная активность восстанавливается. Можете ли вы указать молекулярную основу такого поведения?
14. Разрыв цистиновых поперечных связей:
Поперечные дисульфидные связи образуются в белках в тех случаях, когда два остатка цистеина в одной и той же цепи или в разных цепях подвергаются действию окислителя. При определении аминокислотной последовательности белка по ряду практических соображений сначала следует разорвать все дисульфидные связи. Поскольку это процесс, обратный окислению, его проводят при помощи восстановителя.
а) Один из стандартных способов разрыва дисульфидных мостиков в обработке белка - избытком 2-меркапто-этанола (HSCH2CH2OH). Объясните, на чем основан этот способ.
б) Один из недостатков указанного способа заключается в том, что после разрыва поперечных цистиновых связей они могут образоваться вновь. Почему это происходит?
15. Биосинтез коллагена. Коллаген, количественно преобладающий над всеми другими белками в организме млекопитающих, имеет необычный аминокислотный состав. В отличие от большинства других белков он очень богат пролином и гидроксипролином. Поскольку гидроксипролин не входит в число 20 аминокислот, обычно присутствующих в белках, его включение в коллаген может идти двумя путями: 1) путем ферментативного гидроксилирования пролина в гидроксипролин перед его включением в коллаген и 2) путем гидроксилирования пролина, уже включенного в состав коллагена. Для того, чтобы сделать выбор между этими двумя возможностями, были выполнены следующие эксперименты. Сначала в организм крысы с пищей вводили 14С-пролин и из хвоста выделяли коллаген. При этом оказалось, что новосинтезированный коллаген радиоактивен. Затем точно так же вводили 14Сгидроксипролин, но в этом случае в новосинтезированном коллагене радиоактивности не было обнаружено. Как на основе этих экспериментов сделать выбор между двумя рассматриваемыми возможностями?
16. Образование изгибов и внутрицепочечных поперечных связей в полипептидных цепях.
Укажите, где в изображенном ниже полипептиде возможно образование изгибов или поворотов цепи. Где могут образоваться внутрицепочечные дисульфидные поперечные связи?
иле-ала-гис-тре-тир-глупро-фен-
-глу-ала-ала-мет-цис-мез-три-глу-
-ала-глн-про-асп-гли-мет-глу-цис-
-ала-фен-гис-арг
17. Молекулярная масса гемоглобина.
Первое указание на то, что белки по молекулярной массе намного превосходят известные в то время органические соединения, было получено более 100 лет назад. Например, уже тогда было известно, что гемоглобин содержит 0,34 вес. проц. железа.
а) Исходя из этой информации, определите минимальную молекулярную массу гемоглобина.
б) Последующие эксперименты показали, что истинная молекулярная масса гемоглобина равна 64500. Какую информацию отсюда можно извлечь о числе атомов железа в гемоглобине?
18. Разделение аминокислот методом ионообменной хроматографии.
Анализ смеси аминокислот начинают с разделения этой смеси на компоненты методом ионообменной хроматографии. Небольшое количество смеси вносят в верхнюю пасть колонки, заполненной частицами полистирола, содержащими остатки сульфоновой кислоты. Затем через колонку пропускают буферный раствор. Аминокислоты проходят через колонку с разными скоростями, поскольку их движение тормозят два фактора:
1) электростатическое притяжение между отрицательно заряженными остатками сульфоновой кислоты и положительно заряженными функциональными группами аминокислот;
2) гидрофобное взаимодействие между боковыми цепями аминокислот и сильно гидрофобным остовом полистирольной смолы.
Для каждой из выписанных ниже пар аминокислот определите, какая аминокислота данной Пари будет сводить с колонки первой (т. е. испытывать наименьшее торможение) при пропускании через колонку буфера с рН 7,0:
а) аспарагиновая кислота и лизин
б) аргинин и метионин
в) глутаминовая кислота и валин
г) глицин и лейцин
д) серин и аланнн.
19. Набор трипептидов.
Предположим, что вы хотите синтезировать трипептиды, используя в качестве строительных блоков глинин, аланин и серин.
а) Сколько различных трипептидов можно приготовить при условии, что любая из этих трех аминокислот может занимать любое из трех возможных положений, причем каждую аминокислоту можно использовать более одного раза?
б) Сколько различных трипептидов можно приготовить, если использовать каждую аминокислоту только один раз?


Задания для контроля и самоконтроля знаний
Написать энантиомеры треонина.
Написать диастереоизомеры треонина.
Привести примеры реакций переаминирования.
Запишите формулу аминокислоты аспартата в виде биполярного иона. Покажите поведение его в нейтральной, кислой, щелочной средах.
Записать формулу аминокислоты валина в виде биполярного иона и показать ее поведение (движение к «+» и «-» полюсам) в нейтральной, кислой и щелочной средах.
Записать формулу аминокислоты фенилаланина в виде цвиттериона. При каком значении pH находится ИЭТ?
Записать формулу глутаминовой кислоты в виде биполярного иона. При каком значении pH данная аминокислота заряжена положительно, нейтрально.
Привести примеры реакций окислительного дезаминирования, восстановительного дезаминирования, гидролитического дезаминирования, внутримолекулярного дезаминирования. Назвать продукты реакций.
Привести примеры реакций превращения одних аминокислот в другие (окисление, гидролиз).
Напишите уравнение реакции окисления цистеина в цистин.
Напишите уравнение расщепления треонина.
Написать суммарное уравнение орнитинового цикла.
Напишите структурные формулы всех трипептидов, которые можно получить из аминокислот: аланин. пролин, гистидин. Как рассчитать число возможных пептидов из данного числа аминокислот?
Напишите уравнение реакции образования пептида аланил-пролил-аспарагинил-глицина. Определите заряд.
Напишите уравнение реакции образования пептида триптофил-изолейцил-тирозил-аланина, определите его заряд.
Какие аминокислоты (кислые, основные, нейтральные) преобладают в составе пептида, если ИЭТ лежит в слабокислой среде.
В какой среде лежит ИЭТ следующих пептидов:
а) гли-глу-ала-вал-цис-арг-лей;
б) ала-фен-гли-мет-асн-иле-ала?






ТЕМА 2. ФЕРМЕНТЫ

Занятие 1. Лабораторно-практическое занятие
«Белки – ферменты. Физико-химические свойства ферментов»
3 часа
Цель работы: ознакомиться с каталитической функцией ферментов, изучить основные физико-химические свойства ферментов на примере амилазы.
Оборудование: штатив с пробирками, водяная баня, термометр, стеклянные палочки, предметные стекла, секундомер, термостат.
Реактивы: 0,5-1% раствор крахмала, слюна, разбавленная в 5 раз, раствор Люголя, термометр, предметные стекла, стеклянные палочки, 1/15М дигидрофосфат калия, 1/15М гидрофосфат натрия, фермент амилаза, 1% раствор сахарозы, 10% раствор гидроксида натрия, 1% раствор сульфата меди, дистиллированная вода, 1% раствор хлорида натрия, йод в иодиде калия (раствор Люголя).

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
1. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С. 133-171.
2. Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.195-210.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1- С.226-269.
Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.63-95.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, "Медицина", 2007.- С.75-110.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания об особенностях строения, классификации, физико-химических свойств ферментов. При выполнении лабораторного практикума нужны знания качественных реакций на йод, влияния температуры, рН среды, активаторов и ингибиторов на свойства ферментов.

План занятия
Теоретический практикум.
II. Лабораторный практикум.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

Вопросы для контроля знаний
1. Что такое ферменты?
2. Какова природа ферментов?
3. Что такое апофермент, кофермент, холофермент?
4. Перечислить черты сходства и различия ферментов и неорганических катализаторов.
5. Привести примеры однокомпонентных ферментов.
6. Привести примеры металлосодержащих ферментов.
7. Какие соединения могут быть в качестве коферментов?
8. Привести примеры двухкомпонентных ферментов.
9. Активный центр, субстратный и каталитический участки активного центра. Что такое аллостерический участок, каково его значение?
10. Расположение активного центра в молекуле фермента, биологический смысл такого расположения.
11. Какие аминокислоты играют важную роль в построении активного центра? Какова функция части молекулы фермента, не входящей в активный центр?
12. Влияние на активность ферментов рН, температуры и других факторов.
13. В чем заключается действие ферментов как биокатализаторов?
14. Что понимают под специфичностью действия ферментов?
Какие виды специфичности различают.
15. Теории субстратной специфичности («замка-ключа», «руки-перчатки»).
16. Мультиферментные системы, их биологическое значение.
17. Классификация ферментов.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Влияние температуры на активность ферментов.
Влияние рН среды на активность амилазы слюны.
Специфичность ферментов.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Основной теоретический материал
Ферментативный гидролиз крахмала протекает под влиянием ферментов амилаз, которые содержатся в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге. Источниками амилаз в промышленности служат проросшие зерна злаков и культуры плесневых грибов. Известны
·- и
·-амилазы, которые несколько различаются по характеру действия. Под влиянием
·-амилазы процесс гидролитического расщепления крахмала задерживается на стадии декстринов, а мальтозы образуется немного, тогда как под действием
·-амилазы расщепление идет в сторону преимущественного образования мальтозы. Последовательно этот процесс можно представить следующим образом:
Крахмал Растворимый крахмал Амилодекстрины (фиолетово-синее окрашивание с йодом) Эритродекстрины (буровато-красное окрашивание с йодом) Ахроодекстрины (желтое или буровато-желтое окрашивание с йодом) Мальтодекстрины (с йодом не дают окрашивания) Мальтоза.
Мальтоза под действием фермента мальтазы распадается на две молекулы
·-D-глюкозы. Ход процесса гидролитического расщепления крахмала можно проследить с помощью реакций Троммера, Люголя, характеризующих восстанавливающие свойства углеводов.

Влияние температуры на активность ферментов
1. В 4 пробирки отмерить по 2 мл крахмала. Пробирки поместить в разные температурные условия:
а)   в кипящую водяную баню 100оС
б)  в термостат на 40 оС
в)  оставить в штативе (комнатная температура)
г)   поставить в снег.
Через 10 мин, когда содержимое пробирок примет заданную температуру, во все пробирки добавляют по 0,5мл разбавленной слюны, перемешивают с помощью стеклянной палочки и оставляют в тех же условиях.
Тотчас же начинают делать капельные пробы на стекле. Две капли содержимого второй пробирки капают на стекло, к ним добавляют 1 каплю раствора Люголя. Вначале получается синее окрашивание, через 1-2 мин. пробу повторяют до появления красно-бурой окраски.
Как только окраска содержимого второй пробирки окажется красно-бурой, прибавляют во все пробирки 1-2 капли раствора Люголя и отмечают время окончания ферментативной реакции.
После проведения опыта все пробирки переносятся в штатив и записывают результаты опыта.







Схема записи протокола опыта
№ пробирки
Фермент амилаза, мл
Объем 0,5% крахмала, мл
Температура, оС
Результат опыта с раствором Люголя (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)

1
1
2
100


2
1
2
40


3
1
2
20


4
1
2
0



2. Влияние рН среды на активность амилазы слюны

Содержимое каждой пробирки после прибавления слюны тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20оС) на 1520 мин. Через 10 мин. берут пробы из третьей пробирки, переносят на стеклышко и проделывают реакцию с каплями раствора Люголя. Вначале обычно получается синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное, красно-бурое, желтое. Как только содержимое третьей пробирки будет давать желтое окрашивание, через 12 минуты приливают во все пробирки по 1 капли раствора Люголя.
На основании полученной окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН среды.

Схема записи протокола опыта
№ пробирки
рН буферного раствора
Объем растворов для получения буферного раствора с заданным рН
Субстрат (крахмал) 0,5%
Фермент амилаза
Результат опыта с раствором Люголя (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)



1/15М дигидрофосфата калия
1/15М гидрофосфата натрия




1
5,6
0,25
4,75
1
1


2
6,2
1
4
1
1


3
7
3
2
1
1


4
7,4
4
1
1
1


5
8
4,75
0,25
1
1






Специфичность ферментов
Принцип работы: каждый фермент может катализировать только одну реакцию, действуя на одно вещество или ряд близко родственных веществ. Высокая специфичность - одно из наиболее характерных свойств ферментов. Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов и не оказывает никакого действия на дисахариды. В случае расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу реакция Троммера должна быть положительной. При расщеплении крахмала до глюкозы эта проба также положительна.
Работа проводится с 2 пробирками по следующей схеме:

Реактивы
№ пробирки
Результаты опытов по реакции (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)


1
2
с раствором Люголя
с раствором Троммера

Крахмал
2 мл
-



Сахароза
(1% раствор)
-
2 мл



Амилаза
0,5 мл
0,5 мл




Далее пробирки ставят на 10 минут в термостат при температуре 38оС.
После термостатирования с содержимым пробирок проделывают реакции с йодом на присутствие крахмала и пробу Троммера на присутствие глюкозы:
1 мл исследуемого раствора + 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия + 5 капель 1% раствора сульфата меди.
Пробирку нагревают в кипящей водяной бане. При ферментативном гидролизе крахмала увеличивается количество свободных гликозидных гидроксилов, обуславливающих восстанавливающие свойства, и поэтому мальтоза и глюкоза способны восстанавливать Cu(OH)2 до Cu2O. При наличии глюкозы в растворе появляется желтое окрашивание, переходящее в красное: 
C6H12O6 + 2CuSO4 + 5 NaOH C6H12O7 + 2CuOH+ 2H2O + 2Na2SO4
2CuOH Cu2O + H2O

Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

В данной работе исследуется влияние на каталитическую активность амилазы слюны хлорида натрия и сульфата меди.
Нумеруются три пробирки. В пробирку №1 наливают 1 мл воды; в пробирку № 2 - 0,8 мл воды и 0,2 мл. 1% раствора хлорида натрия, в пробирку № 3 - 0,8 мл воды и 0,2 мл 1% раствора сульфата меди.
Во все пробирки добавляют по 1 мл разведенной слюны и по 1 мл 0,5% крахмала и оставляют на 3 мин. при комнатной температуре. Затем проверяют действие ферментов в пробирке №2, где предполагается наибольшая активность амилазы. Для этого из пробирки №2 отбирают несколько капель и проделывают пробную реакцию с йодом; эту реакцию повторяют каждые 2030 секунд, пока не получат оранжевое или желтое окрашивание. Затем добавляют йод в пробирки № 1, 2, 3. Отмечают окрашивание и записывают результаты в виде таблицы.

Схема записи протокола опыта
№ пробирки
Объем воды, мл
Модулятор
Фермент амилаза, мл
Субстрат (крахмал 0,5%), мл
Результат опыта по реакции с йодом (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)

1
1
-
1
1


2
0,8
0,2 мл хлорида натрия
1
1


3
0,8
0,2 мл сульфата меди
1
1




Вопросы для самопроверки
1. Как объяснить влияние температуры на активность фермента?
2. Каким опытом подтверждается влияние температуры на активность фермента?
3. Каков температурный оптимум для амилазы?
4. По какой реакции мы устанавливаем температурный оптимум?
5. Как объяснить влияние РН на активность фермента?
6. Каким опытом подтверждается влияние рН на активность фермента?
7. Каково оптимальное значение рН для амилазы?
8. По какой реакции мы устанавливаем оптимальное значение рН для амилазы?
9. Каким опытом подтверждается специфичность действия фермента амилазы?
10. По какой реакции мы устанавливаем специфическое действие амилазы на крахмал?
11. Как объяснить влияние активаторов и ингибиторов на активность фермента?
12. Каким опытом подтверждается влияние активаторов и ингибиторов на активность фермента амилазы слюны?
13. По какой реакции мы устанавливаем ингибирующее действие сульфата меди на активность фермента амилазы?
14. По какой реакции мы устанавливаем активирующее действие хлорида натрия на активность фермента амилазы?
15. При изучении каких школьных курсов, каких тем, в каком классе вы будете знакомить учащихся с ферментами?
16. Какая лабораторная работа предусматривается в школьном курсе биологии при изучении пищеварительных ферментов?



Занятие 2. Семинар «Химическая природа и свойства ферментов»
2 часа
Цель: изучить особенности строения, свойств и биологической роли ферментов; рассмотреть основные коферменты нуклеотидной природы, механизм действия и кинетику ферментативных реакций.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
1. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С. 133-171.
2. Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.195-210.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1- С.226-269.
Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.63-95.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, "Медицина", 2007.- С.75-110.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания об особенностях строения, классификации, физико-химических свойств ферментов; механизме действия ферментов, умения разбирать строение основных коферментов.

Вопросы для семинара
Общая характеристика, историческая справка изучения ферментов.
Строение ферментов, ингибирование.
Особенности физико-химических свойств ферментов.
Классификация ферментов по строению.
Механизм действия ферментов.
Кинетика ферментативных реакций.
Изоферменты.
Мультиферментные системы.
Саморегуляция ферментативной активности (ретроингибирование).
Изучение ферментов в школьном курсе биологии и химии.

Вопросы и задания для контроля и самоконтроля знаний
1. Что такое ферменты?
2. История развития учения о ферментах?
3. Какова природа ферментов?
4. Что такое апофермент, кофермент, холофермент?
5. Перечислить черты сходства и различия ферментов и неорганических катализаторов.
6. Привести примеры однокомпонентных ферментов.
7. Привести примеры металлосодержащих ферментов.
8. Какие соединения могут быть в качестве коферментов?
9. Привести примеры двухкомпонентных ферментов.
10. Взаимоотношения между ферментами и коферментами.
11. Коферменты и витамины.
12.Разберите структурную формулу флавинмононуклеотида (ФМН) в окисленной и восстановленной формах. Укажите, в каких реакциях участвует данный кофермент.
13.Разберите структурную формулу флавинадениндинуклеотида (ФАД) в окисленной и восстановленной формах. Укажите, в каких реакциях участвует данный кофермент.
14.Разберите структурную формулу окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАД).
15.Разберите структурную формулу окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ).
16. Активный центр, субстратный и каталитический участки активного центра. Показать на примере ацетилхолинэстеразы.
17. Что такое аллостерический участок?
18. Расположение активного центра в молекуле фермента, биологический смысл такого расположения.
19. Какие аминокислоты играют важную роль в построении активного центра?
20. Какова функция части молекулы фермента, не входящей в активный центр?
21. Свойства ферментов.
22. В каких единицах выражают ферментативную активность?
23. Влияние на активность ферментов рН, температуры и других факторов.
24. Что такое энергия активации?
25. В чем заключается действие ферментов как биокатализаторов?
26. Что понимают под специфичностью действия ферментов? Какие виды специфичности различают?
27. Теория «замка-ключа».
28. Теория индуцированного наведения («руки-перчатки»).
29. Механизм действия ферментов.
30. Явление насыщения фермента субстратом.
31. Разобрать по таблице механизм действия ацетилхолинэстеразы.
32. Что такое субстратная константа, константа Михаэлиса?
33. Какие величины характеризуют степень сродства фермента и субстрата.
34. Уравнение Ментена-Михаэлиса.
35. Процесс активации ферментов, его биологическое значение.
36. Активаторы, механизм их действия.
37. Обратимое, необратимое ингибирование. Привести примеры.
38. Что понимают под конкурентным и неконкурентным ингибированием. Привести примеры.
39. Что такое модуляторы? Каким образом модуляторы регулируют активность ферментов?
40. Изоферменты, их биологический смысл.
41. Мультиферментные системы, их биологическое значение.
42. Ретроингибирование.
43. Иммобилизованные ферменты.
44. Применение достижений энзимологии в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности.




Занятие 3. Лабораторно-практическое занятие
«Определение активности каталазы (по А.Н. Баху и А.И. Опарину)
3 часа
Цель работы: экспериментально определить активность каталазы в различном растительном материале.
Оборудование: колбы, водяная баня, термометр, стеклянные палочки, предметные стекла, воронки, фильтры, бюретки (микробюретки), термостат.
Реактивы: растительный материал, 1 проц. раствор перекиси водорода, 0,1н раствор перманганата калия, 10 проц. раствор серной кислоты.
Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
1. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С. 133-171.
2. Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.195-210.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1- С.226-269.
4.Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.63-95.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.75-110.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания об особенностях строения, физико-химических свойств ферментов на примере каталазы; умения по записыванию уравнений реакций, лежащих в основе данной работы, расстановке коэффициентов в ОВР методом полуреакций. При выполнении лабораторного практикума необходимо знать сущность и особенности перманганатометрии.

План занятия
I. Теоретический практикум.
II. Лабораторный практикум.


I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

1. Особенности строения и биологической роли каталазы.
2. Сущность и особенности перманганатометрии.
3. Уравнения реакций, лежащих в основе работы.

Перманганатометрия
Метод основан на реакциях окисления перманганат-ионом MnO4- в кислой среде:
MnO4- + 8H+ + 5
· Mn2+ + 4H2O.
Практическое применение перманганатометрии весьма многообразно. Восстановители определяют прямым способом титрования, окислители – обратным способом титрования и некоторые вещества – косвенным.
Титрованный раствор перманганата калия по точной навеске приготовить невозможно, так как в нем содержится некоторое количество MnO2 и другие продукты разложения, а также случайные примеси органических веществ в дистиллированной воде, в результате чего концентрация раствора KMnO4 при его хранении изменяется. Поэтому сначала готовят раствор, концентрация которого приблизительно отвечает требуемой концентрации. Раствор хранят в закрытой темной склянке. К определению титра и точной нормальной концентрации приступают через 7-10 дней. За это время перманганат калия окислит все случайные органические примеси, а образовавшийся в результате частичного восстановления MnO2 осядет на дно. Такой отстоявшийся раствор обычно осторожно сливают с осадка или фильтруют через стеклянный фильтр. Приготовленный таким образом раствор KMnO4 хранится в течение длительного времени.
В качестве исходных веществ для установления титра раствора KMnO4 используют безводный оксалат натрия Na2C2O4 или дигидрат щавелевой кислоты H2C2O4 2H2O. Титрование проводят в кислой среде. В нейтральной и щелочных средах образуется темно-коричневый осадок MnO2, что делает невозможным определение точки эквивалентности. Для подкисления используют серную кислоту (азотная кислота – сильный окислитель, соляная кислота обладает восстановительными свойствами).
Для увеличения скорости реакции повышают температуру реагирующих растворов до 60-800С. Реакции, происходящие при титровании перманганатом калия, относятся к автокаталитическим:
2MnO4- + 5 C2O42- + 16H+ 2Mn2+ +10 CO2 + 8 H2O
Образующийся в ходе реакции катион Mn2+ является катализатором данной реакции (автокатализ). Поэтому при титровании первые капли раствора KMnO4 очень медленно обесцвечиваются (пока в растворе нет или мало ионов Mn2+). В ходе титрования концентрация ионов Mn2+ возрастает, и скорость реакции увеличивается. Вследствие этого при титровании не рекомендуется добавлять следующую каплю KMnO4, пока не исчезнет окраска раствора от предыдущей.
Точка эквивалентности устанавливается безиндикаторным способом: при помощи самого раствора KMnO4 по появлению бледно-розовой окраски, вызываемой лишь одной избыточной каплей раствора KMnO4. При титровании малиново-фиолетовая окраска KMnO4 исчезает, так как происходит восстановление MnO4- в Mn2+.

II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Приготовление вытяжки.
Определение активности каталазы.

Основной теоретический материал
Представителем окислительно-восстановительных ферментов является каталаза, которая чрезвычайно интенсивно разлагает перекись водорода по уравнению:
2Н2О2 2Н2О + О2
Перекись водорода является ядовитым для клеток веществом, она образуется в окислительно-восстановительном процессе при восстановлении молекулярного кислорода.
Каталаза - двухкомпонентный фермент. Одним компонентом его является гематин, который представляет собой окисленную простетическую группу гемоглобина крови. Каталаза парализуется синильной кислотой, сероводородом, фторидами.
Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 2MnSO4 + 5O2 + K2SO4 + 8H2O

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности объемов (в мл) 0,1н раствора перманганата калия, израсходованных для титрования в контрольном и рабочем опытах.

Приготовление вытяжки
2г измельченного свежего растительного материала растирают в ступке с кварцевым песком, добавляя 23 мл воды и карбоната кальция для уменьшения кислотности среды. Затем растертую массу количественно переносят в мерную колбу на 100мл, содержимое её хорошо перемешивают, добавляют 2-3 капли толуола, доводят водой до метки и смесь настаивают 1 час при комнатной температуре. После настаивания жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр. В фильтрате тотчас же определяют каталазу.

Определение активности каталазы
Отбирают три пробы прозрачного фильтрата по 20 мл каждая: две опытные и одна контрольная, последнюю кипятят 5 мин. на сетке для инактивации фермента.
К опытным и контрольным пробам прибавляют 25мл 0,1н раствора перекиси и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. По истечении 30 мин. к пробам прибавляют по 5 мл 10 проц. серной кислоты и оставшуюся перекись водорода титруют 0,1н раствором перманганата калия. Об активности каталазы судят по количеству миллиграммов перекиси водорода, которое разрушалось в течение 30 мин. ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала.
Активность каталазы определяют по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415
V1 - объем 0,1н раствора перманганата калия, израсходованного для титрования контроля, в мл
V2 - объем 0,1н раствора перманганата калия, израсходованного на титрование рабочего опыта, в мл
m – навеска исследуемого материала, в г
Vк - объем мерной колбы (мл)
Vп - объем пипетки (мл)
T KMnO4/H2O2 = Сэ(KMnO4) Мэ(Н2О2) / 1000 (г/мл)

Вопросы для самопроверки
1. На чем основано определение каталазы по методу Баха и Опарина?
2. Напишите уравнения реакции, лежащих в основе определения активности каталазы.
3. К какому методу анализа (нейтрализации, редоксиметрии, гравиметрии и т. д.) относится данный метод определения активности каталазы?
4. Какой титрованный раствор в работе является рабочим?
5. Какой метод и способ титрования применяется при выполнении данной работы?
6. С какой целью проводят контрольное титрование?
7. Каким способом устанавливается точка эквивалентности?
8. Что такое титр перманганата калия по перекиси водорода и как его рассчитать?



Занятие 4. Семинар «Ферменты – биокатализаторы.
Классификация ферментов»
3 часа
Цель: изучить особенности строения, свойств и биологической роли ферментов; рассмотреть основные коферменты нуклеотидной природы, механизм действия и кинетику ферментативных реакций.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
1. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С. 133-171.
2. Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.195-210.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1- С.226-269.
4.Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.63-95.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.75-110.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания об особенностях классификации и разных групп ферментов; умения записывать уравнения реакций под действием ферментов разных классов.

План занятия
I. Теоретический практикум.
II. Решение задач.
I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
Номенклатура ферментов.
Классификация ферментов.
Оксидоредуктазы.
Гидролазы.
Лиазы.
Лигазы.
Изомеразы.
Трансферазы.

II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
1. Напишите уравнения реакций образования ПВК, ЩУК и
·-кетоглутаровой кислоты из соответствующих аминокислот. Назовите ферменты, катализирующие данные процессы.
2. Приведите уравнения реакций, катализируемых:
а) липазами,
б) фосфатазами,
в) гликозидазами,
г) амидазами,
д) C-N-лиазами,
е) синтетазами,
ж) C-C-лиазами,
з) C-O-лиазами,
и) триозофосфатизомеразами,
к) глюкофосфатизомеразами,
л) фосфоглицеромутазами,
м) фосфоглюкомутазами,
н) эпимеразами,
о) дегидрогеназами,
п) киназами,
о) фосфорилазами,
с) ацилтрансферазами.
3. Напишите уравнение реакции, катализируемой ферментом:
УДФглюкоза: Дфруктоза-2-гликозилтрадсферазой. Указать класс и подкласс фермента.
4. Напишите уравнение реакции, катализируемой ферментом:
L-аспартат: пируватаминотрансфераза. Указать класс и подкласс фермента.
5. Напишите уравнение реакции превращения молочной кислоты в пировиноградную. Назовите фермент, укажите класс, подкласс.
6. Напишите уравнение реакции и назовите фермент, укажите класс: метионин + АТФметиониладенилат + ФФ.

Вопросы и задания для контроля и самоконтроля знаний
1. Номенклатура ферментов, тривиальная, рациональная, научная. Каковы принципы, положенные в основу номенклатуры ферментов?
2. Каков смысл четырех чисел, составляющих шифр каждого фермента?
3. Классификация ферментов.
4. Каковы характерные черты действия оксидоредуктаз?
5. Оксидоредуктазы. Пиридинзависимые дегидрогеназы.
6. Оксидоредуктазы. Флавинзависимые дегидрогеназы.
7. Какие ферменты называют первичными и вторичными дегидрогеназами? Какова их биологическая функция.
8. Какие вещества являются коферментами первичных и вторичных дегидрогеназ?
9. Какие ферменты называют цитохромами? Какова их классификация и биологическая роль?
10. Какова последовательность расположения цитохромов в цитохромной системе, входящей в дыхательную цель?
11. Разберите структурные формулы простетической группы цитохромов.
12. Оксидазы.
13. Характеристика гидролаз. На основании каких критериев делят на подклассы ферменты гидролазы?
14. Характеристика сериновых протеиназ, кислых протеиназ, металлосодержащих протеиназ, тиоловых протеиназ.
15. В чем состоит специфичность действия на пептидные связи пепсина, трипсина, химотрипсина?
16. К какому классу и подклассу ферментов относятся амилазы?
17. Как осуществляется переход неактивной формы трипсина (претрипсина, трипсиногена) в активную форму?
18. Перечислите важнейшие ферменты, катализирующие гидролиз белков, пептидов.
19. Характеристика трансфераз. На основании каких критериев делят на подклассы ферменты трансферазы?
20. Перечислите важнейшие коферменты трансфераз и укажите, в каких процессах они участвуют.
21. Разберите структурную формулу коэнзима А, укажите, в каких реакциях он участвует.
22. Характеристика лиаз. На основании каких критериев делят на подклассы ферменты лиазы?
23. Характеристика изомераз. На основании каких критериев делят на подклассы ферменты изомеразы?
24. Характеристика лигаз.
25. К какому классу относятся ферменты, катализирующие реакции аминокислот по радикалу.



ТЕМА 3. УГЛЕВОДЫ

Занятие 1. Семинар «Углеводы»
3 часа
Цель: изучить особенности строения, свойств и биологической роли наиболее важных представителей и отдельных групп углеводов.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.309-338.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.155-164.
Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 302-323.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.140-150.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.297-367.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания формул, особенностей строения, изомерии и свойств углеводов, их классификации, биологической роли разных групп углеводов. Необходимы умения по записи формул важнейших альдоз и кетоз, изомеров (аномеров, эпимеров, энантиомеров); моносахаридов в виде формул Фишера, Хеуорза; формул отдельных дисахаридов (сахароза, мальтоза, целлобиоза, лактоза) и полисахаридов растительного (целлюлоза, крахмал), животного (гликоген, хитин) и бактериального (декстаны) происхождения.
План занятия
Теоретический практикум.
Решение задач.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
Общая характеристика углеводов, их биологические функции.
Классификация углеводов.
Общие свойства и строение моносахаридов.
Стереоизомерия моносахаридов.
Важнейшие представители моносахаридов.
Дисахариды: строение и свойства. Важнейшие представители.
Полисахариды, их строение, свойства.
Важнейшие представители полисахаридов.
9. Нарушения углеводного обмена в организме.
10. Изучение темы «Углеводы» в школьном курсе биологии.

Частные вопросы к теоретическому практикуму «Углеводы»
1. Какие соединения называются углеводами?
2. Какова общепринятая формула углеводов, моносахаридов? Всегда ли она соответствует действительности? Привести примеры.
3. Классификация углеводов.
4. Что такое ассиметричный атом углерода? Синоним этого понятия,
5. Как определяется число стереоизомеров?
6. Как определяется отношение изомеров к D- и L-формам?
7. Напишите проекционные формулы D- и L-глюкозы, D- и L-2-дезоксирибозы.
8. Что такое аномерный атом углерода? Дайте синонимы этого понятия.
9. Для каких структур характерны
·- и
·-изомеры моносахаридов? Напишите формулы
·- и
·-глюкозы,
·- и
·-дезоксирибозы.
10. Что такое пиранозные, фуранозные формы гексоз?
11. С биологической точки зрения какие изомеры моноз наиболее важны, наиболее часто встречаются в природе?
12. Что такое эпимеры? Приведите примеры.
13. Физические и химические свойства моносахаридов (альдоз и кетоз).
14. Что такое мутаротация? Инверсия?
15. В чем причина оптической активности Дглюкозы?
16. Что означает «редуцирующие сахара»?
17. Обладают ли дисахариды восстанавливающими свойствами?
18. Что такое гликозидная связь?
19. Обладает ли сахароза редуцирующими свойствами? Чем обусловлены редуцирующие свойства одних дисахаридов и отсутствие их у других?
20. Какие соединения называются гетерополисахаридами, гомополисахаридами? Привести примеры.
21. Характеристика крахмала. Строение амилозы, амилопектина.
22. Обладает ли крахмал восстанавливающими свойствами?
23. Перечислите виды амилаз, существующих в природе. Укажите к какому классу и подклассу относятся эти ферменты. Отметьте характерные черты их действия (субстрат, тип расщепления связи, продукт реакции).
24. Что такое декстрины?
25. Установите сходство и различие между фосфоролизом и гидролизом полисахаридов. Приведите примеры.
26. Какие ферменты пищеварительного тракта действуют на полисахариды и дисахариды, и какими железами внутренней секреции они выделяются?
27. Почему в желудке прекращается расщепление крахмала амилазой слюны?
28. Какова сравнительная скорость всасывания отдельных гексоз и пентоз?
29. Какое максимальное количество гликогена может отложиться в печени человека?
30. Какие углеводы понимают под «сахаром крови»? Каково содержание сахара в крови в норме?
31. Сколько калорий (килоджоулей) выделяется при сгорании 1г углеводов?
32. Назовите продукты питания, богатые углеводами.
33. Сколько граммов углеводов человек должен получать в сутки?
34. Какие нарушения в обмене углеводов наблюдаются при сахарном диабете, и каким путем удается их устранить?
35. Какова роль гормонов поджелудочной железы и надпочечников в обмене углеводов? Какое влияние оказывает инсулин и адреаналнн на содержание сахара в крови и каков механизм этого влияния?
36. Дайте характеристику гормона инсулина,
37. Врожденные нарушения обмена углеводов.

II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
1. Напишите уравнения реакций гидролиза и фосфоролиза мальтозы. Назовите ферменты, катализирующие эти реакции. К какому классу и подклассу относятся эти ферменты?
2. Напишите уравнения реакций гидролиза и фосфоролиза лактозы. Назовите ферменты, катализирующие эти реакции. К какому классу и подклассу относятся эти ферменты?
3. Напишите уравнения реакций гидролиза и фосфоролиза сахарозы. Назовите ферменты, катализирующие эти реакции. К какому классу и подклассу относятся эти ферменты?
4. Приведите проекционные формулы (по Хеуорсу) фрагментов молекул: а) амилозы, б) амилопектина, состоящих из 4-5 звеньев. Укажите типы связей между моносахаридными остатками.
5. Напишите проекционную формулу (по Хеорсу) фрагмента молекулы гликогена (4, 5 звеньев). Какие типы связей между остатками моноз имеются в этом полисахариде?
6. Напишите формулу фрагмента молекулы целлюлозы (из 4-5 звеньев). Напишите уравнение гидролиза целлюлозы до целлобиозы. Укажите редуцирующий и нередуцирующий концы фрагмента молекулы целлюлозы и целлобиозы.
7. Напишите структурные формулы исходных соединений и продуктов реакции в приведенном уравнении реакции:
8. Выразите структурными формулами превращение
УДФ глюкоза УДФгалактоза. Назовите фермент.
9. Фруктозо-1,6-дифосфат + Н2Офруктозо-6-фосфат + НЗРО4.
Назовите фермент, ускоряющий эту реакцию. К какому классу и подклассу относится данный фермент?
Напишите структурные формулы исходных соединений и продуктов реакции в приведенном уравнении реакции (фермент: сахарозоглюкозилтрансфераза):

·-Д-глюкоза-1-фосфат +
·-Д-фруктоза Х+У
11. Составьте схему однократного гидролитического действия
·-амилазы на крахмал.
12. Напишите структурные формулы продуктов реакции и исходных веществ в приведенном уравнении:

·-Д-глюкоза-1-фосфат + глюкозаХ+У, если она осуществляется при участии мальтозофосфорилазы.
13. Сравнение целлюлозы и гликогена.
Практически чистая целлюлоза, полученная из волокон, окружающих семена растений (хлопчатник), представляет собой прочное, волокнистое, совершенно нерастворимое в воде вещество. Гликоген же, выделенный из мышц пли печени, напротив, легко диспергируется в горячей воде, образуя мутный раствор. Несмотря на различие в физических свойствах, оба этих вещества - полимеры, обладающие близкими молекулярными массами и состоящие из остатков Дглюкозы, соединенных
·-14-связями. Какими особенностями строения обусловлены различия в свойствах этих двух полисахаридов? Какое биологическое значение имеют особенности физических свойств этих соединений?

Расчетные задачи
При сбраживании 250 г глюкозы получено 100 г этилового спирта. Какой это процент теоретически возможного?
Рассчитать, сколько металлического серебра можно получить при взаимодействии 18 г глюкозы с аммиачным раствором оксида серебра, если выход продукта реакции, составляет 75 проц. Какой объем (при н. у) газа выделится при спиртовом брожении такого же количества глюкозы, если считать, что процесс протекает только на 75 проц.
Сколько граммов глюкозы было подвергнуто спиртовому брожению, если при этом выделилось столько же газа, сколько его образуется при полном сгорании 16 г метилового спирта?
Сколько граммов глюкозы потребуется для получения 11, 2 л этилена путем 2х последовательных процессов - спиртового брожения и дегидратации образующегося спирта? Выход этилена составляет 50 проц.
Какое количество глюкозы потребуется для получения брожением 100 л этилового спирта, если его выход составляет 90 проц.
Какое количество клетчатки и азотной кислоты необходимо израсходовать для получения 1т тринитроклетчатки, если потери производства составляют 12 проц.

Задания для контроля и самоконтроля знаний
Напишите проекционные формулы D-глюкозы и L- глюкозы.
Напишите формулы
·-D-глюкозы и
·-D-глюкозы,
·-D-2-дезоксирибозы и
·-D-2-дезоксирибозы.
Напишите формулы
·-D- фруктофуранозы,
·-D-фруктопиранозы.
Напишите циклические формулы следующих гексоз: фруктозы, маннозы, галактозы.
Напишите проекционные формулы альдоз, эпимерных Д-галактозе, Д-рибозе. Назовите эти соединения.
Напишите циклические формулы N-ацетилглюкозамина и N-ацетилгалактозамина.
Напишите формулы
·-метилглюкозида,
·-метилглюкозида.
Напишите проекционные формулы альдоз, эпимерных Д-галактозе, Д-рибозе. Назовите эти соединения.
Глюкоза при восстановлении образует спирт сорбит. Напишите формулу.
Глюкоза при окислении может образовывать глюконовую, глюкуроновую и глюкаровую кислоты. Напишите формулы этих соединений.
11. Приведите проекционные формулы (по Хеуорсу) фрагментов молекул: а) амилозы, б) амилопектина, состоящих из 45 звеньев. Укажите типы связей между моносахаридными остатками.
12. Напишите формулу фрагмента молекулы целлюлозы (из 45 звеньев). Напишите уравнение гидролиза целлюлозы до целлобиозы.
13. Напишите формулу декстранов, укажите типы связей, биологическую роль этих соединений.
14. Напишите формулу хитина, укажите тип связи, биологическую роль этого соединения.
Занятие 2. Лабораторно-практическое занятие
«Методы биохимических исследований. Рефрактометрия»
3 часа
Цель: изучить особенности рефрактометрического метода, устройство и принцип действия прибора; провести экспериментальные определения с помощью данного метода.
Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
Иоффе Б. В. Рефрактометрические методы химии, 3 изд., Л., 1983.- С.3-63.
Ляликов Ю.С. Физико-химические методы анализа. М., "Химия", 1973.- С.124-140.
Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания сущности рефрактометрии, областей применения этого метода, устройстве рефрактометра. Работа проводится студентами полностью самостоятельно: сначала изучается теоретический материал, затем следует экспериментальная часть исследования.
План занятия
Теоретический практикум.
Лабораторный практикум.
I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Принцип рефрактометрии.
Устройство прибора.
Правила обращения и методика работы.

Основной теоретический материал
Принцип метода
Определение содержания сухих веществ в соке овощных культур, ягод, плодов, содержания белка и белковых фракций в сыворотке крови приобретает все большее значение для объективной оценки качества овощных культур, сахарной свеклы, ягод, плодов по мере роста в связи с агротехническими условиями и сортовыми особенностями, при оценке состояния обмена веществ у сельскохозяйственных животных. Показатели эти могут быть использованы и для оценки полноценности их кормления.
В основе рефрактометрии лежит свойство различных сред по-разному преломлять проходящие через них лучи света. Переходя из одной среды в другую, луч света меняет свое направление - преломляется. Отношение синуса угла падения к синусу угла преломления (рефракция) носит название показателя преломления (коэффициента преломления). Величина рефракции раствора зависит от количества, величины, физического состояния растворенных в нем частиц и температуры среды.
Величина рефракции света в сыворотке крови зависит, главным образом, от содержания белков. Минеральные вещества и другие составные части сыворотки крови практически не влияют на коэффициент ее рефракции. Для определения показателя преломления света используют специальные приборы -рефрактометры.
Устройство прибора
Универсальный лабораторный рефрактометр (рис. 4) состоит из чугунного основания, станины, камеры прибора, состоящей из нижней и верхней половинок (с установленными в них осветительной и измерительной призмами). Для поддержания определенной температуры в половинках камеры имеются полости, через которые с помощью резиновых шлангов пропускают воду (в зависимости от температуры окружающей среды через шланги пропускают теплую или холодную воду). На кронштейне прибора установлена зрительная труба, неподвижно соединенная со шкалой коэффициентов преломления. Вместе со зрительной трубой камера с помощью рычага может вращаться вокруг оси.
[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]
окуляр рычаги основание камера

Рис.4. Рефрактометр лабораторный

Правила обращения и методика работы
Перед началом работы прибор необходимо проверить и установить на нуль. Для этого приподнимают верхнюю половину камеры и на призму наносят несколько капель дистиллированной воды, камеру закрывают и устанавливают на резкость окуляр шкалы и окуляр зрительной трубы. Зеркало устанавливают так, чтобы свет от источника через окно поступал в осветительную призму и равномерно освещал поле зрения. Рукояткой устраняют спектральную окраску границ светотени. Указательную линию окуляра шкалы устанавливают на делении 1,3332 и смотрят в зрительную трубу. Если граница светотени проходит через центр пересечения линий, то прибор установлен на нуль. Если этого нет, то при помощи ключа необходимо вращать винт в зрительной трубе до тех пор, пока граница светотени не окажется в центре пересечения линий.
При просмотре большого количества проб установку прибора на нуль проверяют несколько раз.
II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Определение сухих веществ в соке овощей, плодов и ягод
при помощи рефрактометра.
Определение общего белка сыворотки крови.
Определение показателя преломления растительных масел.

Определение сухих веществ в соке овощей, плодов и ягод
при помощи рефрактометра
Для объективной оценки качества овощных культур и сахарной свеклы, а также ягод и плодов по мере роста (в связи с агротехническими условиями и сортовыми особенностями) ценные показания может дать рефрактометрическое определение сухих веществ в нескольких каплях сока, выжатого из растения. Каждое определение требует несколько минут (не считая получение сока). Для получения сока пробу овощей растирают на терке и отжимают через марлю. Затем из пипетки (не прикасаясь кончиком ее к поверхности призмы наносят 26 капли сока на нижнюю призму рефрактометра и производят отсчет через окуляр, как описано ранее. Отсчитав коэффициент преломления на шкале слева от окуляра, находим по таблице 2 содержание воды в исследуемом соке (в проц.). Очевидно, содержание сухих веществ составит разность между 100 и процентом влаги. Если работа проведена не при 20 град., то вносят поправку (как указано в таблице 1). Для этого из найденного по таблице 2 содержания воды отнимают некоторую величину, если анализ производился при температуре ниже 20 град., или к найденному значению содержания воды прибавляют некоторую величину, если анализ выполнялся при температуре выше 20 град. И уже после введения поправки вычисляют содержание сухих веществ.
Таблица 1
Поправки к показаниям рефрактометра при температурах, отличающихся от нормальных 20 град

% воды в продукте при t
95
90
85
80
70
60
50
40
30
20

От найденного значения отнять

15
0,25
0,27
0,31
0,31
0,34
0,35
0,36
0,37
0,36
0,36

17
0,16
0,18
0,20
0,20
0,22
0,23
0,23
0,23
0,20
0,17

19
0,06
0,08
0,08
0,08
0,08
0,09
0,09
0,08
0,07
0,05

К найденному значению прибавить

21
0,06
0,07
0,07
0,07
0,07
0,07
0,07
0,07
0,07
0,07

23
0,18
0,20
0,20
0,21
0,21
0,21
0,23
0,21
0,22
0,22

25
0,30
0,32
0,32
0,34
0,36
0,36
0,38
0,36
0,36
0,37

27
0,43
0,46
0,46
0,48
0,50
0,51
0,55
0,52
0,50
0,51

29
0,57
0,60
0,61
0,62
0,66
0,67
0,71
0,68
0,65
0,67

Таблица 2
Определение процентного содержания воды в сахарных растворах по найденному показателю преломления при 20 град.

Показатель преломления при 20 град
Проц. воды
Показатель преломления при 20 град
Проц. воды

1,3330
100,0
1,3596
82,5

1,3337
99,5
1,3604
82,0

1,3344
99,0
1,3612
81,5

1,3351
98,5
1,3620
81,0

1,3358
98,0
1,3629
80,5

1,3365
97,5
1,3637
80,0

1,3372
9
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·9,5

1,3530
86,5
1,3828
69,0

1,3538
86,0
1,3838
68,5

1,3546
85,5
1,3847
68,0

1,3554
85,0
1,3856
67,5

1,3562
84,5
1,3865
67,0

1,3571
84,0
1,3874
66,5

1,3579
83,5
1,3884
66,0

1,3587
83,0
1,3893
65,5




Определение общего белка сыворотки крови
После установки прибора на нуль верхнюю половину камеры приподнимают и призмы вытирают досуха неворсистой салфеткой. Затем на поверхность призмы наносят 12 капли сыворотки крови и быстро закрывают камеру. Вращая рукоятку прибора и наблюдая в окуляр зрительной трубы, находят границу светотени; ее окрашенность устраняют. Затем рукояткой точно совмещают границу светотени с точкой пересечения двух линий. Смотрят в окуляр шкалы и отсчитывают коэффициент преломления раствора. Показания записывают и по шкале Рейсса (табл. 3) находят содержание белка в сыворотке крови.

Таблица 3
Данные для пересчета показаний рефрактометра на содержание белка в сыворотке крови

Показатель преломления
Содержание белка в сыворотке крови (проц.)
Показательпреломле-
ния
Содержание белка в сыворотке крови (проц.)

1,3420
3,50
1,3520
9,35

1,3425
3,80
1,3525
9,63

1,3430
4,10
1,3530
9,89

1,3435
4,38
1,3535
10,20

1,3440
4,66
1,3540
10,47

1,3445
4,96
1,3545
10,75

1,3450
5,25
1,3550
11,00

1,3455
5,54
1,3555
11,31

1,3460
5,85
1,3560
11,60

1,3465
6,12
1,3565
11,87

1,3470
6,41
1,3570
12,24

1,3475
6,71
1,3575
12,50

1,3480
6,98
1,3580
12,90

1,3485
7,27



1,3490
7,58



1,3495
7,85



1,3500
8,17



1,3505
8,44



1,3510
8,76



1,3515
9,03




3.Определение показателя преломления растительных масел
Показатель преломления характеризует чистоту, ненасыщенность, степень окисления жиров. Показатель преломления возрастает при наличии оксигрупп, увеличении молекулярной массы и количества непредельных жирных кислот, входящих в состав жира. Изменение температуры приводит к изменению плотности вещества. С повышением температуры на 10С плотность снижается в среднем на 0,0007. Следовательно, показатель преломления уменьшается. Для жиров показатель преломления определяют при температуре 200С (n20C) или путем расчета приводят к 200С.
Для определения показателя преломления растительного масла служат рефрактометр, воронка, коническая колба, стеклянная палочка.
Пробу исследуемого растительного масла хорошо перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. На призму рефрактометра наносят 2-3 капли масла и, установив определенную температуру, по истечении 5 минут, отсчитывают с точностью до 0,0002.
Если показатель преломления определяется при температуре выше или ниже 200С, то его приводят к 200С по формуле:
n20 C = nt + (t-20) . 0,00035, где
n20 C – показатель преломления при 200С
nt – показатель преломления при температуре опыта
t – температура опыта
0,00035 – коэффициент поправки к показателю преломления при изменении температуры на 10С
Время проведения испытания – 10 минут.
По величине показателя преломления можно судить о природе масла, его чистоте и степени окисления. Показатели преломления различных видов масла приведены в таблице 4.

Таблица 4
Показатели преломления растительных масел

Вид масла
Показатель преломления

Подсолнечное
1,4736-1,4762

Соевое
1,4722-1,4754

Хлопковое
1,4742-1,4768

Арахисовое
1,4680-1,4720

Льняное
1,4880-1,4870

Конопляное
1,4717-1,4780

Кукурузное
1,4720-1,4740

Горчичное
1,4730-1,4769

Масло какао
1,4530-1,4580

Бараний жир
1,4510-1,4583

Говяжий жир
1,4510-1,4583

Свиной жир
1,4506-1,4586


В окисленном масле показатель преломления выше по сравнению с показателем преломления свежего масла в результате увеличения молекулярной массы (вследствие присоединения кислорода, оксигрупп).
Методику определения содержания сухих веществ в плодах, овощах, ягодах можно использовать для определения содержания сухих веществ в готовой продукции (томатопродукты, сладкая консервная продукция, соки и т.д.).
При исследовании темноокрашенных продуктов или объектов, от которых трудно отделить жидкую фазу, применяют следующий прием. В фарфоровую чашечку берут из средней пробы образца навеску 5-10г с точностью до 0,01г, добавляют около 4г кварцевого песка и дистиллированной воды в объеме, равном массе (весу) взятой навески. Смесь быстро и тщательно растирают пестиком, небольшое количество растертой массы переносят на кусочек вдвое сложенной марли, немедленно выжимают сок (отбрасывая первые две капли) на призму прибора и отсчитывают по шкале показания рефрактометра.
Содержание сухих веществ X (в %) для данного случая вычисляют по формуле X=2a, где а – содержание сухих веществ с учетом поправки на температуру.

Вопросы для самопроверки
Принцип работы рефрактометра.
Устройство прибора.
Правила работы с рефрактометром.
Приведение прибора в рабочее состояние.
Методика определения сухих веществ в соке овощей, плодов и ягод при помощи рефрактометра.
Методика определения общего белка сыворотки крови.
Методика определения показателя преломления растительных масел.







ТЕМА 4. ЛИПИДЫ

Занятие 1. Семинар «Липиды»
3 часа
Цель: изучить особенности строения, свойств и биологической роли наиболее важных представителей и отдельных групп липидов.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.420-470.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.16-170.
Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 325-352.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.151-164.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.370-379.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания формул, особенностей строения, свойств липидов, их классификации, биологической роли разных групп липидов. Необходимы умения по записыванию формул представителей важнейших групп простых и сложных липидов.
План занятия
Теоретический практикум.
Решение задач.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
Общая характеристика липидов.
Биологическая роль липидов.
Классификация липидов.
Простые липиды.
Сложные липиды.
Биологические мембраны.

Частные вопросы к теоретическому практикуму «Липиды»
1. Какие вещества относятся к липидам?
2. На чем основано разделение липидов на группы?
3. Как классифицируют в настоящее время липиды?
4. В чем отличие простых липидов от сложных?
5. Приведите примеры простых липидов.
6. Какие карбоновые кислоты относят к жирным высшим кислотам? Приведите примеры насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.
7. Укажите на различия в структуре и свойствах насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.
8. Нейтральные жиры, их химическая структура, свойства.
9. Чем отличаются растительные жиры от животных?
10. Каковы функции жиров в живых организмах. Чем отличаются по составу и биологической роли запасные жиры от структурных?
11. Какие химические процессы протекают при прогоркании растительных масел?
12. Какие вещества относят к сложным липидам? На какие группы делят сложные липиды?
13. В чем заключается биологическая роль сложных липидов для животных организмов? Что такое липопротеины?
14. Какие липиды относят к группе фосфолипидов? Как их классифицируют?
15. Что такое глицерофосфолипиды, сфинголипнды их биологическая роль?
16. Какие структурные компоненты входят в состав молекулы лецитина?
17. Какие функции выполняют фосфолипиды в живых организмах?
18. Какова структура и физиологическая роль гликолипидов?
19. Какие липиды относят к группе стеролов и стеридов?
20. Чем отличаются стеролы от стеридов?
21. Какие соединения называют стероидами?
22. Холестерол, строение, физиологическая роль.
23. Производные холестерола, желчные кислоты, стероидные гормоны, витамин Д, их физиологическая роль.
24. Какова структура восков?
25. Роль ненасыщенных жирных кислот в организме.
26. Что такое неомыляемая фракция липидов?
27. Физиологическая роль липидов в организме.
28. Перечислите основные функции липидов.


РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ

1. Сколько граммов жира, представляющего собой чистый триолеат, было взято, если для гидрирования образовавшейся в результате его гидролиза кислоты потребовалось столько литров водорода, сколько его выделяется при взаимодействии 38,4г метилового спирта с металлическим натрием.
2. Оливковое масло содержит 80% (по массе) триацилглицерола одноосновной ненасыщенной карбоновой кислоты с одной двойной связью. Выведите формулу этого триглицерола, если известно, что 1,105 кг оливкового масла содержит 1 моль этого триацилглицерола.
3. Из 2,704 кг пчелиного воска выделили 1 моль мирицилового эфира пальмитиновой кислоты, что составляет 25% (по массе). Напишите структурную формулу этого сложного эфира, считая , что мирициловый спирт это одноатомный спирт с нормальной цепью углеродных атомов(С31).
4. Жир массой 44,5г, представляющий собой триацилглицерол только одной предельной органической кислоты, нагрели с 70 мл 20%-ного раствора гидроксида натрия (р = 1,2г/см3). Для нейтрализации избытка гидроксида натрия потребовалось 22,5 мл 36,5%-ной соляной кислоты (р=1,2г/см3). Какие органические соединения при этом образовались и каковы их массы?
5. Раствор, полученный после нагревания 40,3 г жира, образованного только одной органической кислотой с 70 мл 20%-ного раствора гидроксида натрия (пл. 1,2), потребовал для нейтрализации избытка щелочи 22,88 мл 36,5%-ного раствора хлористоводородной кислоты (плотность 1,18 г/мл). Какая кислота входила в состав жира? Какие вещества и в каком количестве получились при реакции со щелочью? Какая реакция может произойти при дальнейшем добавлении раствора кислоты к полученной смеси? Напишите все необходимые уравнения реакций.
6. Жидкая, не растворимая в воде кислота А реагирует с соединением В в стехиометрическом соотношении 3:1, образуя при этом вещество С, которое является представителем одного из важнейших классов веществ, входящих в состав пищи. Приведите возможные формулы веществ А, В, С. Напишите уравнения реакций.
7. Соединение А - жидкость с приятным запахом, при гидролизе А образуются два соединения с одинаковым числом атомов углерода. Одно из соединений В окисляется оксидом меди (II) в вещество С, использующееся для сохранения биологических препаратов, т.к. способно свертывать белки. Приведите формулы веществ А, В, С. Напишите уравнения реакций.
8. Напишите формулы фосфатидилхолина, содержащего линолевую и пальмитиновую кислоты, инозитфосфатида, содержащего пальмитиновую и лауриновую кислоты, и холестерида, содержащего линоленовую кислоту.
9. Напишите формулы фосфатидилэтаноламина, содержащего олеиновую и стеариновую кислоты, ацетальфосфатида, содержащего стеариновый альдегид и линолевую кислоту, и цереброзида, содержащего любую (по выбору) жирную кислоту. Какие жирные кислоты обычно входят в состав цереброзидов?
10. Напишите формулы серинфосфатида, содержащего линоленовую и миристиновую кислоты, сфингомиелина, содержащего олеиновую кислоту, и холестерида, содержащего линолевую кислоту.

Задания для контроля и самоконтроля знаний

Напишите формулу сложных эфиров, образованных:
а) цетиловым спиртом (С16) и пальмитиновой кислотой,
б) мерициловым спиртом (С30) и пальмитиновой кислотой.
Напишите структурную формулу триацилглицерола олеопальмитостеарата.
Напишите формулу триацилглицерола, состоящего из пальмитиновой, стеариновой, линолевой жирных кислот.
Напишите структурные формулы лецитинов, кефалинов. Какие жирные кислоты содержатся обычно в лецитинах?
Напишите формулу фосфатидилхолина, фосфатидилсерина.
Напишите уравнения реакций с указанием соответствующих ферментов:
а) ферментативного гидролиза тристеарата,
б) активирования пальмитиновой кислоты,
в) синтеза ацетилхолина,
г) гидролиза ацетилхолина.
Произрастающие в засушливых районах суккуленты обычно покрыты восковым налетом. Как это способствует выживанию растений?
Некоторые из применяемых в кулинарии жиров (сливочное масло) быстро портятся при хранении на воздухе при комнатной температуре, тогда как свойства твердых жиров (маргарин) в аналогичных условиях меняются мало. Почему?
Жирные кислоты как источник воды. Вопреки распространенному мнению горб верблюда вовсе не хранит в себе запасы воды; это просто большой запас жира. Как может этот жир служить источником воды? Вычислите количество воды (в литрах), которое может образоваться в теле верблюда из 1 кг жира. При этом для простоты исходите из того, что весь этот жир представлен трипальмитином.
Какая часть молекулы триацилглицеролов содержит больше биологически доступной энергии (в расчете на один атом углерода): остатки жирных кислот или остаток глицерола? Как можете вы обосновать свой ответ, исходя из химической структуры триацилглицеролов?
Заполните пропуски в следующих утверждениях:
-а. Молекулы липидов в биологических мембранах образуют непрерывный двойной слой толщиной 5 нм, называемый ---------------
-б. В мембранах клеток присутствуют три основных типа липидов, а именно ---------------, --------------- и ---------------.
-в. Все мембранные липиды - ---------------, поскольку один конец их молекул гидрофильный, а другой – гидрофобный.
-г. Гидрофильный конец молекулы фосфолипида состоит из --------------- головы, а гидрофобная часть состоит из двух --------------- хвостов.
-д. При помещении амфипатических молекул в водную среду они агрегируют таким образом, что их гидрофильные концы контактируют с водой, а гидрофобные спрятаны внутри. В результате этого возникают структуры двух типов: сферические --------------- или плоские ---------------. В обеих структурах гидрофобные хвосты размещаются между слоями гидрофильных головок.
-и. Липиды, содержащие олигосахариды и называемые ---------------, присутствуют только в наружной половине бислоя. Их углеводные группы экспонированы на поверхности клетки.















ТЕМА 5. ВИТАМИНЫ

Занятие 1 . Семинар «Витамины»
3 часа
Цель: изучить основные витамины, их классификацию и биологическую роль в организме; рассмотреть нарушения, связанные как с недостаточным, так и с избыточным потреблением витаминов.

«Все – яд. И все – польза. Все дело в количестве»
(народная мудрость)
План занятия

I. Теоретический практикум.
II. Доклады студентов.
III. Решение задач.
Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.470-493.
2. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 273-299.
3. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.124-138.
4. Сидорская Э.А. Витамины / Сидорская Э.А., Афиногенова С.Г. – Арзамас: АГПИ, 1990.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимы знания об истории изучения, классификации, характерных особенностях строения, свойствах и биологической роли разных групп витаминов. Подготовку докладов по витаминам осуществлять по нижеприведенному плану.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
1. Что такое биоактивные соединения? Назовите некоторые группы их,
2. Общие понятия о витаминах и их классификация. Биологическая роль витаминов.
3. Кем и когда были открыты витамины?
4. Что такое а-, гипо, -гипервитаминозы?
5. Что такое витамерия? Какие витамины имеют витамеры?
6. Витаминоподобные соединения.
7. Антивитамины, антибиотики.
8. Характеристика витаминов: химическое строение, признаки и последствия авитаминоза, источники витаминов, их роль в обмене веществ.

ДОКЛАДЫ СТУДЕНТОВ
Характеристика отдельных витаминов по плану:
- название витамина;
- химическое строение, место в классификации;
- роль в обмене веществ;
- источники витамина;
- признаки и последствия гипер-, гипо- и авитаминоза.
а) витамин А (ретинол);
б) витамин Д (кальциферол);
в) витамин Е (токоферол);
г) витамин К (филлохинон);
д) витамин В1 (тиамин);
е) витамин В2 (рибофлавин);
ж) витамин В3 (нантотеновая кислота);
з) витамин РР (никотинамид);
и) витамин В6 (пиридоксин);
к) витамин В12 (цианокобаламин);
л) витамин Вс (фолиевая кислота);
м) витамин С (аскорбиновая кислота);
н) витамин Р (рутин);
о) витамин Н (биотин).

III. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
ЗАДАЧА 1. Потребность в никотиновой кислоте. Недостаток никотиновой кислоты в пище приводит к заболеваниюпеллагре:
а) суточная потребность взрослого человека в никотиновой кислоте, составляющая 7,5 мг, уменьшается, если в пище содержится большое количество аминокислоты триптофана. Что можно сказать о взаимосвязи между никотиновой кислотой и триптофаном на основе этого наблюдения?
б) В конце прошлого и начале нашего столетия пеллагра было довольно распространенным заболеванием, особенно в сельских местностях на юге США, где люди употребляли в пищу мало мяса, а питались в основном кукурузой. Объясните, почему такое питание приводило к недостаточности никотиновой кислоты?
ЗАДАЧА 2. Яичные белки предохраняют желтки от порчи.
Яйца можно держать в холодильнике от четырех до шести недель, не опасаясь, что они испортятся. Если отделить яичные желтки от белков, то они быстро испортятся даже при низкой температуре.
а) Почему портятся желтки?
б) Как вы объясните этот факт, что наличие яичных белков предотвращает порчу желтков?
в) Какую пользу, с биологической точки зрения, приносит птицам такой способ защиты яиц?
ЗАДАЧА 3. Периодичность применения витаминов. Витамины А и Д можно применять сразу за один прием в том количестве, которого достаточно для поддержания их нормального уровня в течение нескольких недель. Витамины же группы В необходимо применять значительно чаще. Почему?
ЗАДАЧА 4. Недостаточность витамина А. Недостаточность витамина А вызывает ксерофтальмию - заболевание, сопровождающееся потерей зрения; для более ранних стадий характерны сухость и тусклость роговицы глаза. Дети в значительно большей степени подтверждены этому заболеванию, чем взрослые. В тропических странах от ксерофтальмии слепнут десятки тысяч детей в возрасте от 16 до 36 месяцев. В то же время у взрослых, добровольно находившихся в течение двух лет на диете без витамина А, отмечалось лишь ослабление зрения в условиях пониженной освещенности. После введения витамина А этот дефект быстро исчезал. Объясните, чем обусловлены различия в проявлении недостаточности витамина А у взрослых и детей.
ЗАДАЧА 5. Витамин С. Отличается ли искусственно синтезированный витамин от природного. Производители пищевых продуктов, богатых витаминами, утверждают, в частности, что витамины, полученные из природных источников, полезнее для здоровья, чем синтезированные искусственным путем. Считается, например, что чистая L-аскорбиновая кислота (витамин С) из плодов шиповника полезнее L-аскорбиновой кислоты, синтезированной на химическом заводе. Различаются ли витамины из этих двух источников? Может ли организм различать витамины из разных источников?
ЗАДАЧА 6. Роль витамина В6 в метаболизме. Когда человек переходит на рацион с высоким содержанием белка, у него возрастает потребность в витамине В6. Дайте объяснение этому явлению.
ЗАДАЧА 7. Действие варфарина и дикумарола. Варфарин продажный препарат, применяемый для борьбы с грызунами, является мощным антагонистом витамина К; его введение в организм блокирует действие витамина К.

варфарин
а) Предложите молекулярный механизм действия варфарина в качестве антагониста витамина К.
б) Почему скармливание грызунам варфарина приводит к их гибели?
в) Если коров или лошадей кормить неправильно приготовленным клевером, то у них развивается заболевание, сопровождающееся сильными внутренними кровотечениями. Было установлено, что причиной этого служит дикумарол - вещество, образующееся в результате действия микроорганизмов на кумарин-обычный компонент клевера. В клинической практике дикумарол используют для лечения больных с острым тромбофлебитом (образование кровяных сгустков, закупоривающих просвет сосуда). Объясните принцип этого лечения.

Дикумарол
ЗАДАЧА 8. Недостаточность цинка в организме человека.
В некоторых странах Ближнего Востока, главным образом в Иране и Египте, у людей встречаются случаи недостаточности цинка. Это объясняется тем, что население в этих странах употребляет в пищу очень большое количество хлебных злаков, для которых характерно высокое содержание фитиновой кислоты (миоинозилгексафосфата), очень прочно связывающей катионы двухвалентных металлов, особенно ионы цинка.
а) Почему употребление хлебных злаков приводит к недостаточности цинка?
б) Недостаточность цинка особенно часто наблюдается в отдаленных деревнях, где люди пекут хлеб из пресного недрожжевого теста.
В городах, где в пищу употребляют хлеб из дрожжевого теста, недостаточность цинка встречается значительно реже. Объясните эти наблюдения.







Занятие 2. Лабораторно-практическое занятие
«Количественное определение витамина С»
3 часа
Цель работы: экспериментально определить количественное содержание витамина С в различных продуктах и отработать методику проведения данных реакций.
Оборудование: весы, ножи из нержавеющей стали, конические колбы на 100мл, промывалки, мерные колбы на 100мл, воронки, пипетки на 510мл, фильтры бумажные, микробюретки, фарфоровые ступки, толченое стекло.
Реактивы: 1 проц. раствор хлороводородной кислоты, 1 проц. раствор щавелевой кислоты, 1 проц. раствор крахмала, 0,001 н. раствор 2,6дихлорфенолиндофенола (0,25г натриевой соли 2,6-дихлорфенол-индофенола растворяют в 700мл воды, перемешивают и добавляют 300мл 0,1М фосфатного буфера, рН 7,0; 0,001н раствор иодата калия (растворяют 0,3568г иодата калия в 1л воды, полученный 0,01 н. раствор разбавляют в 10 раз); аскорбиновая кислота, иодид калия, 2 проц. раствор серной кислоты.
Материалы: капуста (свежая, квашеная), шиповник, лимон, апельсин, лук зеленый, яблоко.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.470-493.
2. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 273-299.
3. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007. - С.124-138.
4. Сидорская Э.А. Витамины / Сидорская Э.А., Афиногенова С.Г. – Арзамас: АГПИ, 1990.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимы знания о физико-химических свойствах витамина С, его физиологической роли, качественных реакций на витамин и уравнений реакций, лежащих в их основе, расстановке коэффициентов в ОВР методом полуреакций. При выполнении лабораторного практикума необходимы знания методики и особенностей редоксиметрических определений.

План занятия
Теоретический практикум.
Лабораторный практикум.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

1. Физико-химические свойства витамина С.
2. Физиологическая роль витамина.
3. Качественные реакции на витамин С.

Основной теоретический материал
Аскорбиновая кислота является необходимым для жизни человека веществом. Принимает участие в окислительно-восстановительных процессах в организме. Увеличивает сопротивление организма к инфекционным заболеваниям.
Аскорбиновая кислота – бесцветное кристаллическое вещество с температурой плавления 1920С. Легко растворима в воде и спирте, является сильным восстановителем, кислотные свойства ее обусловлены диссоциацией двух катионов водорода из енольных гидроксилов. Легко окисляется йодом, отдавая два электрона, при этом переходит в дегидроаскорбиновую кислоту. Процесс окисления аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту обратимый.
Наиболее характерными химическими свойствами аскорбиновой кислоты являются ее кислотность, обусловленная енольным водородом при третьем атоме С, и легкое окисление до дегидроаскорбиновой кислоты, катализируемое ионами металлов и аскорбатоксидазой.
Дегидроаскорбиновая кислота нестабильна в щелочной среде, в которой происходит гидролиз лактонного кольца с образованием дикетогулоновой кислоты. Восстанавливающая способность аскорбиновой кислоты является основой большинства количественных аналитических методов ее определения.
Аскорбиновая кислота является необходимым для жизни человека веществом. Принимает участие в окислительно-восстановительных процессах в организме. Увеличивает сопротивление организма к инфекционным болезням.

L-аскорбиновая
кислота

L-дегидроаскорбиновая
кислота
L-дикетогулоновая
кислота





Качественные реакции на витамин С
Взаимодействие витамина С с раствором йода.
Взаимодействие витамина С с гексацианоферратом (III) калия.
Взаимодействие витамина С с краской Тильманса (2,6-дихлорфенол- индофенолом).

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Основной теоретический материал
Метод основан на способности аскорбиновой кислоты в кислой среде восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол до лейкоформы и окисляться в дегидроформу по уравнению:


Ход работы
Навеску (510г) растительного материала, измельченного ножом из нержавеющей стали, тщательно растирают в фарфоровой ступке с 35 г толченного стекла и 10мл 1 проц. раствора хлороводородной кислоты. По мере растирания прибавляют еще 25мл соляной кислоты и всю смесь переносят в мерную колбу на 100мл. Остаток в ступке смывают в ту же колбу раствором щавелевой кислоты, доводя объем смеси до метки.
Содержимое колбы перемешивают и фильтруют. 10мл фильтра переносят в конические колбочки и титруют из микробюретки 0,001н раствором 2,6дихлорфенолиндофенола до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек. Одновременно проводят контрольное титрование смеси реактивов. Объем (в мл) раствора краски, пошедшей на контрольное титрование, вычитают из объема, краски, пошедшей на титрование вытяжки.
Расчет содержания аскорбиновой кислоты в мг проц. (мг аскорбиновой кислоты на 100г материала) производят по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415, где
А - объем краски, пошедшей на титрование вытяжки, мл
В - объем краски, пошедшей на контрольное титрование, мл
Т - титр краски по аскорбиновой кислоте, мг/мл
Vк - общий объем экстракта мл
Vп - объем экстракта, взятого для титрования, мл
m - масса исследуемого материала, г.
Для определения титра краски по аскорбиновой кислоте растворяют несколько кристаллов (1-1,5 мг без взвешивания) аскорбиновой кислоте в 50мл 2 проц. раствора серной кислоты. Берут в две конические колбочки по 5мл этого раствора и титруют из микробюреток: в одной колбочке - 0,01н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, в другой - точно 0,001н раствором иодата калия, предварительно добавив в колбочку несколько кристалликов иодита калия и 5 капель 1 проц. раствора крахмала. Расчет титра краски по аскорбиновой кислоте:
Ткр/аскор.кисл.= 13 EMBED Equation.3 1415 , где
а - объем точно 0,001н раствора иодита калия, (мл)
b - объем раствора краски, мл;
0,088 означает, что 1 мл 0,001н раствора иодата калия соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты.
В результате расчета устанавливают, какому количеству миллиграммов аскорбиновой кислоты соответствует 1 мл данного раствора краски.

Йодометрическое определение аскорбиновой кислоты
Количественное определение аскорбиновой кислоты основано на окислении ее раствором иода:

Стандартный потенциал окисления аскорбиновой кислоты Е равно 0,71 в
С6H8O6 - 2
· C6Н8О6 + 2Н+
Стандартный потенциал восстановления иода (Е =0,53 в)
I2 + 2
· 2I-
Разность потенциалов процесса окисления аскорбиновой кислоты иодом будет достаточно большой. ЭС равно 0,53 (1,24 в), поэтому иод может быть использован для количественных определений.
Эквивалент аскорбиновой кислоты равен 13 EMBED Equation.3 1415
Методика определения
К 15 мл раствора аскорбиновой кислоты, отмеренной пипеткой, прибавляют 1 мл раствора крахмала и титруют рабочим раствором иода до появления неисчезающего синего окрашивания.
По результатам титрования аскорбиновой кислоты титрованным раствором иода рассчитывают количество аскорбиновой кислоты, содержащейся в 100 мл исследуемого раствора, ее процентное содержание (см. выше формулу).

Вопросы для самопроверки
1. Физические и химические свойства витамина С. Химическое строение витамина С. Напишите структурные формулы окисленной и восстановленной форм аскорбиновой кислоты.
2. Отношение витамина С к окислителям, нагреванию, к изменению рН среды.
3. Почему витамин С называется кислотой?
4. Какова суточная потребность в витамине С и сколько этого витамина выделяется с мочой?
5. Зависит ли потребность витамина С от возраста, выполняемой работы, функционального состояния и климатических условий?
6. Клинические симптомы недостаточности витамина С.
7. Какое заболевание вызывает отсутствие в пище витамина С?
8. О чем свидетельствует отсутствие витамина С в моче?
9. Физиологическая роль витамина С.
10. Какие свойства аскорбиновой кислоты и 2,6-дихлорфенолиндофенола положены в основу метода количественного определения витамина С?
11. На чем основан метод количественного определения витамина С?
12. Почему титрование витамина С проводят в кислой среде?
13. Что такое Т рабочего раствора по определяемому веществу?
Ткраски|аскор. кислоте?
14. Какие пищевые продукты наиболее богаты витамином С?
15. Какое количество исследуемого продукта может покрыть суточную потребность в витамине С?
16. Изучение данной темы в школьных курсах биологии.




ТЕМА 6. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Занятие 1. Семинар «Молекулярная природа генетического материала»
3 часа
Цель: изучить химическую природу, особенности строения и свойства нуклеиновых кислот, выяснить зависимость их функций от строения, рассмотреть классификацию нуклеиновых кислот.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.178-204.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.182-188.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т3. - С.852-891.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т2 – С.5-12, С.53-58.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.140-148.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания особенностей строения и свойств нуклеиновых кислот, их классификации, биологической роли; особое внимание обратить на зависимость между строением, свойствами и функциями нуклеиновых кислот. Необходимы умения по записи формул азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов, цепочек ДНК и РНК; вычислению содержания (в %) азотистых оснований в молекулах нуклеиновых кислот.

План занятия
I. Теоретический практикум.
II. Решение задач.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
История открытия нуклеиновых кислот, изучение их биологической роли.
Химический состав, строение нуклеозидов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот.
Биологические функции нуклеотидов. Нуклеотиды - коферменты, макроэргические соединения, регуляторы метаболизма.
Отличия в химическом составе и строении ДНК и РНК.
ДНК - материальный носитель генетической информации.
Уровни структурной организации ДНК. Работы Чаргаффа, Уотсона, Крика.
Классификация и характеристика всех типов РНК.
Изучение данной темы в курсах биологии и химии.

Частные вопросы к теоретическому практикуму
«Молекулярная природа генетического материала»
1. История открытия нуклеиновых кислот (работы Мишера, Альтмана, Левина, А. Н. Белозерского).
2. История развития представлений о биологической роли НК. ДНК - материальный носитель наследственной информации (опыты Гриффитса, Эвери, Херши, Чейза).
3. Нуклеотиды, нуклеозиды, нуклеопротеины.
4. Приведите примеры специфических нуклеопротеиновых комплексов.
5. Азотистые основания нуклеиновых кислот, строение, свойства, таутомерия. Минорные азотистые основания.
6. Биологические функции нуклеотидов. Нуклеотиды - коферменты и макроэргические соединения, регуляторы метаболизма. Привести примеры.
7. Как понимать «АТФ - универсальная энергетическая валюта в биологических процессах».
8. Что такое макроэргнческая связь?
9. Запас АТФ в клетках ограничен. При каких процессах происходит регенерация АТФ, форфорилирование АДФ и АТФ?
10. Какова средняя продолжительность жизни каждом молекулы АТФ у человека?
11. АТФ, его функции.
12. Химический состав нуклеиновых кислот. Отличия в химическом составе ДНК от РНК.
13. Связи, стабилизирующие нуклеотидные остатки в полинуклеотиде.
14. Правила Чааргаффа. Исследования Чааргаффа и А.Н. Белозерского по таксономической роли первичной структуры ДНК.
15. В чем состоит принцип комплиментарности в строении ДНК?
16. Какие части ДНК несут наследственную информацию, а какие структурную?
17. Характеристика, основные параметры (шаг, число пар нуклеотидных остатков на витке, расстояние между нуклеотидными остатками по высоте, диаметр двойной спирали ДНК). Работы Крика, Уотсона.
18. Какова минимальная молекулярная масса биологически активной, функциональной ДНК?
19. Какие два типа ДНК, судя по содержанию в их составе азотистых оснований, представлены в природе? В каком направлении идет эволюция ДНК?
20. Чем объясняется разнообразие молекул ДНК?
21. Первичная структура ДНК. Работы Сенджера, Гилберта.
22. Вторичная структура ДНК и ее полиморфные формы (А, В, Z, SBS, другие формы) двойной спирали.
23. Третичная структура ДНК.
24. Что означает термин «кольцевая ДНК»?
25. Что такое экзоны и интроны?
26. Что такое плазмиды, их значение в устойчивости бактерий к некоторым антибиотикам.
27. Что такое рекомбинантные ДНК, их значение. Рестрикция. Ферменты-рестриктазы.
28. Что такое релаксированная ДНК?
29. Физико-химические свойства ДНК.
30. Денатурация, ренатурация ДНК.
31. Что такое плавление ДНК? Температура плавления ДНК?
32. Какой тип ДНК (АТ- или ГЦ-тип) имеет более высокую точку плавления? Почему?
33. Какие виды ДНК, исходя из ее локализации в клетке, известны в настоящее время?
34. Сравнить клетки эукариот и прокариот по содержанию ДНК.
35. Каковы размеры ДНК в клетке?
36. Что такое, с химической точки зрения, гены, хромосомы, хроматин?
37. Отличаются ли по химическому составу хромосомы прокариот от эукариотических хромосом?
38. Дать характеристику белкам-гистонам.
З9. Что такое структурные гены, регуляторные гены?
40. Каковы размеры генов? Как рассчитать длину гена, молекулярную массу гена?
41. Классификация РНК.
42. Строение, свойства, функции и локализация в клетке и-РНК. Роль и-РНК в биосинтезе белка.
43. Строение, свойства, функции и локализация в клетке т-РНК. Роль т-РНК в биосинтезе белка в переносе аминокислот. Понятие об антикодоне.
44. Строение, свойства, функции и локализация в клетке р-РНК.
45. Первичная, вторичная, третичная структуры т-РНК. Работы Холли, Баева.
46. Сколько существует видов т-РНК, особенности их строения.

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
1. ДНК одного мутанта бактериофага имеет контурную длину 15 мкм вместо 17 мкм. Сколько пар оснований не достает у этого мутанта?
2. В препаратах ДНК, выделенных из двух видов бактерий, содержание аденина составляет соответственно 32 и 17 проц. общего содержания оснований. Какие относительные количества гуанина, цитозина, тимина содержатся в этих двух препаратах ДНК? Одна из этих бактерий выделена из горячего источника (64 град.). Какая из ДНК принадлежит термофильной бактерии? На чем основывается ваш ответ?
3. Одна из цепей двухспиральной ДНК имеет следующий нуклеотидный состав (относительное молекулярное содержание): А равно 0,30, Г равно 0,24. Что можно сказать о содержании Т, Ц той же цепи? Что можно сказать о содержании А, Г, Т, Ц в комплементарной цепи?
4. Какое минимальное число нуклеотидных пар содержится в гене, кодирующем панкреатическую рибонуклеазу (124 аминокислоты). Почему число нуклеотидных пар может оказаться гораздо больше, чем в вашем ответе? С чем связана такая неопределенность?
5. ДНК человека. Чему равна масса молекул двухцепочной ДНК (г) протяженностью от Земли до Луны (прибл. 384000км)? Каждая тысяча нуклеотидных пар двойной спирали ДНК весит 10-18г. Один км равен 1012нм, а размер одной нары оснований составляет 0,34нм. Для сравнения интересно отметить, что в организме человека содержится приблизительно 0,5г ДНК.

Задания для контроля и самоконтроля знаний
1. Напишите химические формулы компонентов, входящих в состав всех дезоксирибонуклеотидов.
2. Напишите химические формулы компонентов, входящих в состав всех видов рибонуклеотидов.
3. Написать формулы и дать названия четырех основных дезоксирибонуклеотидов.
4. Написать формулы и дать названия четырех основных рибонуклеотидов, функционирующих как структурные и кодирующие единицы РНК.
5. Напишите химические формулы минорных оснований: 5-метилцитозина, 1-метилгуанина и соответствующие им формулы нуклеозидов.
6. Напишите формулы уридина, тимидина.
7. Напишите формулы гуаниловой, цитидиловой кислот, дезоксиаденилата, уридилата, дезоксигуанозин-5-монофосфата.
8. Напишите уравнение реакции кислотного гидролиза АТФ в соответствии со схемой:
АТФ пирофосфат + аденин + рибоза-5-фосфат.
9. Под действием, фермента аденилаткиназы идет реакция:
АГФ + АМФ 2АДФ. Написать полное уравнение реакции.
10. Напишите формулу динуклеотида, входящего в состав ДНК, в котором в качестве оснований были бы аденин и гуанин.
11. Указать, какие ферменты осуществляют следующие превращения:
а) уридин-3-монофосфат + Н2О уридин + Н3Р04
б) аденозин + Н3PО4 аденин + рибозо-1-фосфат
в) цитидин + Н2О цитозин + рибоза
12. Написать уравнение реакции и указать соответствующий фермент ГМФ ГДФ



























VII cеместр, IV курс

ТЕМА 7. ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Занятие 1-2. Лабораторно-практическое занятие «Выделение ДНК»
4 часа
Цель: экспериментальным путем выделить ДНК из исследуемого материала.
Оборудование: фарфоровые чашки, пестики, мерные стаканы, фильтры, весы, стеклянные палочки, стекло. кристаллизатор со льдом, марля, центрифуга, центрифужные пробирки, шприцы
Реактивы: 10% раствор додецилсульфата натрия в 45% этаноле, физиологический раствор 0,9% NaCl, экстрагирующий буфер (0,15М раствор NaCl, содержащего 0,05 моль цитрата натрия, pH которого доведен до 8,5 добавлением карбоната лития), порошок «Лотос», этанол, смесь хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), дистиллированная вода.
Материал: селезенка крупного рогатого скота.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.178-204.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.182-188.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т3. - С.852-891.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т2 – С.5-12, С.53-58.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.140-148.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимо повторить материал об особенностях строения и свойствах нуклеиновых кислот, их классификации, биологической роли; особое внимание обратить на структуру молекулы ДНК, состав нуклеопротеинов, на ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты. Необходимы умения по записыванию цепочек ДНК; уравнений реакций под действием нуклеаз, нуклеотидаз, нуклеозидаз.
План занятия
I. Теоретический практикум.
II. Лабораторный практикум.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

Биологическая роль, физико-химические свойства ДНК.
Строение ДНК.
Уровни структурной организации ДНК.
Ферменты расщепления ДНК.
Нуклеосомы.

II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Основной теоретический материал
Нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков – нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений.
Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами, обусловленными остатками ортофосфорной кислоты в их составе, и при физиологических значениях рН несут отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важнейших свойств нуклеиновых кислот - способность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с ионами магния), а также с полиаминами.
Поэтому для выделения нуклеиновых кислот из комплексов с белками, необходимо прежде всего разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Кроме того, в клетке всегда есть активные нуклеазы, заключенные преимущественно в лизосомах и переходящие в свободное состояние при гомогенизации тканей. Таким образом, при выделении нуклеиновых кислот необходимо особое внимание уделить инактивации нуклеаз, полноте гомогенизации и очистке препарата от примесей (белков, полисахаридов, полифосфатов и др.).
Существует несколько методов получения нуклеиновых кислот, в их числе хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография, ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы сефаррозы, гель-электрофорез, метод распределения в двухфазных полимерных системах по Альбертсону и др.
Но все эти методы или требуют довольно сложного оборудования (например, ультрацентрифуги) или определенных условий работы (например, работа ведется при низкой температуре 030С или в вакууме), или дорогостоящих реактивов. Предложенная методика вполне применима, доступна не только на лабораторно-практических занятиях в институте, но и на кружковых, факультативных занятиях в школе.



Ход работы
С целью ингибирования поверхностных нуклеаз 5г селезенки промыть в 15-20мл 10% раствора додецилсульфата натрия в 45% этаноле (5мин). Слить. Затем промыть в 15-20мл физиологического раствора 0,9% NaCl (5мин), затем 3-5 раз в охлажденной дистиллированной воде, периодически помешивая.
Подсушить фильтровальной бумагой и растереть на холоде в фарфоровой чашке в течение 5-10мин до тонкой суспензии, можно с кварцевым песком или Al2O3. Сильное растирание не рекомендуется, т.к. нарушается нативное состояние.
В чашку постепенно добавить 30-40мл экстрагирующего буфера (0,15М раствор NaCl, содержащего 0,05 моль цитрата натрия, pH которого доведен до 8,5 добавлением карбоната лития) + 5мл 10% додецилсульфата натрия в 45% этаноле. Экстракцию вести в чашке, помещенной в кристаллизатор со льдом в течение 20мин.
Отфильтровать через 3-4 слоя марли, фильтрат собрать в мерный химический стакан.
Для депротеинизации добавить примерно 1-2г додецилсульфата натрия (порошок «Лотос»–2М или –М или «Новость»). Перемешивать в течение 10-15 мин.
Добавить равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), перемешать, встряхивать 15-25мин.
Отцентрифугировать при 8000 об/мин в течение 10 мин.
Отобрать шприцом верхнюю водную фазу.
Из прозрачной водной фазы осадить ДНК двойным объемом охлажденного до +4оС этанола.
Осторожно помешав стеклянной палочкой, получить ДНК в виде медузы.

Вопросы для самопроверки
Характеристика, основные параметры двойной спирали ДНК.
Первичная структура ДНК. Работы Сенджера, Гилберта.
Вторичная структура ДНК и ее полиморфные формы.
Третичная структура ДНК.
Физико-химические свойства ДНК.
Ферменты расщепления ДНК.
Экстракция.
Депротеинизация.
Нуклеосомы, их организация.


Занятие 3-4. Семинар «Механизмы передачи наследственной информации»
4 часа
Цель: изучить основные этапы передачи генетической информации, их особенности и значение для организма; рассмотреть свойства генетического кода и этапы биосинтеза белков, механизмы регуляции обмена нуклеиновых кислот.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.213-237.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.182-188.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т3 – С.894- 962.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т2 – С.64-107.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.149-180.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания об основных этапах в передаче генетической информации, ферментах, катализирующих данные процессы, значении генетического кода для них. Необходимы умения по записи уравнений химических реакций, лежащих в основе процессов реализации генетической информации.

План занятия
I. Теоретический практикум.
II. Решение задач.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
Основной постулат молекулярной биологии и биохимии.
Биосинтез ДНК (репликация).
Биосинтез РНК (транскрипция).
Обратная транскрипция и проблемы онкологических заболеваний.
Свойства генетического кода.
Рибосомы, их строение.
Основные стадии биосинтеза:
а) активация аминокислот: роль АТФ и фермента аминоацил- т - РНК - синтета- зы в этом процессе;
б) инициация, функционально активная рибосома;
в) элонгация, этапы транслоксации, пептидилтрансферазная реакция;
г) терминация синтеза полипептидной цепи.
8. Врожденные нарушения биосинтеза белка (серповидно - клеточная анемия и др. наследственные болезни).
9. Регуляция синтеза белка.
10. Изучение данной темы в школьных курсах биологии и химии.

Частные вопросы к теоретическому практикуму
«Механизмы передачи генетической информации»
1. В чем суть центрального постулата молекулярной биологии, молекулярной биохимии?
2. Гипотезы возможных механизмов репликации ДНК.
3. Синтез ДНК. Работы Корнберга.
4. ДНК-полимераза. Условия, необходимые для ее действия.
5. Роль предсуществующей, затравочной ДНК в синтезе ДНК.
6. Современные представления о репликации ДНК. Фрагменты Оказаки.
7. Ферменты синтеза ДНК (ДНКполимераза, праймаза, хеликаза, нуклеаза, ДНК-лигаза и др.).
8. Возможна ли одновременная репликация обеих цепей?
9. Ведущая и отстающая цепи ДНК в процессе репликации.
10. Что такое праймер?
П. Как происходит репликация в прокариотических и эукариотических ДНК?
12. Репликационная вилка. Сколько их может быть в процессе репликации ДНК?
13. Степень точности процесса репликации в сравнении с процессами транскрипции и трансляции. Объяснить, какое значение это имеет для сохранности видов?
14. Способность ДНК к гибридизации, репарации.
15. Транскрипция. РНКполимераза, условия, необходимые для ее действия.
16. Что такое спейсер, сплайсинг, процессинг?
17. В чем суть транскрипционного процессинга?
18. Обратная транскрипция и проблема раковых заболеваний. Исследования Гершензона, Темина, Балтимора и др.
19. Понятие о гене, генетическом коде, кодоне. Основные свойства кода. Работы Ниренберга, Маттеи, Лидера, Кораны.
20. Аппарат биосинтеза белка.
21. Рибосомы, их строение, химический состав, участие в биосинтезе белка. Полирибосомы. Работы А.С. Спирина.
22. Основные этапы биосинтеза белка:
а) активация аминокислот. Аа-т-РНК, их структура, свойства, функции.
Роль АТФ и ферментов аминоацил-т-РНК-синтетаз в этом процессе;
о) инициация, функционально активная рибосома;
в) элонгация, транслокация, пептидилтрансферазная реакция;
г) терминация синтеза полипептидной цепи;
д) сворачивание полипептидной цепи и процессинг.
23. Влияние факторов внешней среды на биосинтез белка в организме.
24. Врожденные нарушения биосинтеза белка. Молекулярные болезни на примере серповидно-клеточной анемии.
25. Регуляция синтеза белка. Теория Жакоба и Моно.
26. Безматричный синтез полипептидов. Успехи генной инженерии.
27. Биосинтез белков и незаменимых аминокислот для практических целей.
28. Общие представления о биосинтезе и деградации нуклеотидов.
29. Биосинтез пуриновых нуклеотидов.
30. Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов.
31. Указать происхождение группировок атомов пуринового и пиримидинового кольца.
32. Распад НК и образование конечных продуктов обмена. Ферменты расщепления НК.
33. Распад пиримидиновых оснований.
34. Распад пуриновых оснований.

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
1. Сколько богатых энергией фосфатных связей затрачивается на синтез белка из 200 остатков, если исходить из готовых аминокислот.
2. Состав оснований транскрипта РНК. Цепь ДНК, содержащая 105 нуклеотидных остатков в соотношении А – 21%, Г – 29%, С – 29%, Т – 21% реплицируется при помощи ДНКполимеразы с образованием комплементарной цепи. Полученную двухцепочечную ДНК затем используют в качестве матрицы для РНКполимеразы, которая транскрибирует новую цепь ДНК. В результате синтезируется РНК такого же размера, как и матрица.
а) Определите нуклеотидный состав образующейся РНК.
б) Предположим, что РНКполимераза остановилась, пройдя только 2000 остатков новой цепи ДНК. Каким будет нуклеотидный состав новой короткой РНК?
3. Нуклеотидный состав ДНК, синтезированных на одноцепочечных матрицах. Определите нуклеотидный состав ДНК, синтезированной на матрице, представляющей собой двухцепочечную кольцевую ДНК фага ф174, (т. е. репликативную форму ДНК этого фага), если нуклеотидный состав одной из цепей таков: А - 24,7%, Г - 24,1%, Ц - 18,5%, Т – 32,7%. Какое допущение необходимо сделать, чтобы решить эту задачу?
4. Какую последовательность аминокислот кодирует следующая последовательность оснований молекул мРНК? Считайте, что рамка считывания начинается с (5’) конца?
(5’)УУГЦЦУАГУГАУУГГАУГ(3’)
5. Какова последовательность полипептида, который образуется при добавлении поли (УУАЦ) в бесклеточную систему синтеза белка?
6. Одноцепочечную РНК вируса табачной мозаики обработали химическим мутагеном. Получены мутанты, у которых в определенном положении вместо пролина располагается серии или лейцин. Повторная обработка мутантной РНК тем же мутагеном привела к появлению в том же положении фенилаланина.


сер

про фен
лей

Каковы предполагаемые кодоны для этих четырех аминокислот?
7. Репликативные вилки в кишечной палочке и в клетках человека.
а) Какое время необходимо для репликации гена рибонуклеазы кишечной палочки (104 аминокислотных остатка), если репликативная вилка движется со скоростью 750 пар оснований в секунду?
б) Репликативная вилка в клетке человека движется всего лишь в 10 раз медленнее, чем в кишечной палочке. Какая дополнительная информация потребуется вам, чтобы рассчитать минимальную скорость репликации гена человека, кодирующего белок из 104 аминокислотных остатков.
8. Напишите уравнение реакции активирования лизина, назовите фермент.
9. Напишите уравнение реакции, катализируемой ферментом метионил-т-РНК-синтетазой.
10. Спаривание оснований при репликации и транскрипции.
а) Напишите нуклеотидную последовательность участка ДНК, синтезируемого ДНКполимеразой, имея в виду, что нуклеотидные последовательности принято писать в направлении 5’ 3’
5’ - ГЦТТГЦААЦГТТГЦАТТАГ - 3’
б) Напишите нуклеотидную последовательность участка матричной РНК, транскрибируемой РНКполимеразой при использовании в качестве матрицы новосинтезируемой цепи ДНК, полученной в п. а. этой задачи.
11. Запишите нуклеотидную последовательность ДНК, которая кодирует следующую полипептидную цепочку: -ала-лей-гис-про-вал-.

Задания для контроля и самоконтроля знаний
1. Напишите структурную формулу фрагмента полинуклеотидной цепочки -ГГАЦ-. Укажите последовательность нуклеотидов в комплементарном ему фрагменте.
2. Напишите нуклеотидную последовательность одной цепи двухцепочечной ДНК, другая цепь которой имеет последовательность
(5’)АТГЦЦГТАТГЦА(3’).
3. Напишите фрагмент двойной спирали ДНК, структура одной из цепочек которой включает -АТАЦ-.
4. Объясните назначение ферментов и дайте им другие, более распространенные названия:
ДНК-зависимая-ДНК-полимераза,
ДНК-зависимая-РНК-полимераза,
РНК-зависимая-ДНК-полимераза,
РНК-зависимая-РНК-полимераза.
5. Запишите в простейшем виде уравнение реакции синтеза ДНК.
6. Запишите в простейшем виде уравнение реакции синтеза РНК.
7.Запишите в простейшем виде уравнение полинуклеотидфосфорилазной реакции.
8. РНКсодержащие вирусы. Могут ли гены состоять из РНК? В составе РНКсодержащих вирусов кишечной палочки ДНК нет, в них присутствует лишь РНК, которая выполняет роль вирусной хромосомы. Это означает, что в таких вирусах гены состоят из РНК, а не из ДНК. Опровергает ли это центральную догму молекулярной генетики? Обоснуйте свой ответ.
9. Напишите уравнение реакции, катализируемой ферментом фенилаланил-т-РНК-синтетазой.
10. Ведущая и отстающая цепи. Составьте список предшественников и ферментов, необходимых для синтеза ведущей и отстающей цепей при репликации ДНК.
11. Точность репликации ДНК.
а) Какие факторы обеспечивают точность репликации в ходе синтеза ведущей цепи новой ДНК?
б) Можно ли ожидать, что отстающая цепь синтезируется с той же точностью, что и ведущая? Поясните ваш ответ.
12. Различия между РНКполимеразой и полинуклеотидфосфорилазой. РНКполимераза требует для транскрипции в качестве предшественников нуклеозид-(5’)-трифосфаты, а с нуклеозид-(5’)-дифосфатами она не работает. Полинуклеотидфосфорилаза, наоборот, требует нуклеозид-(5’)-фосфаты, а с (5’)-трифосфатами она не работает.
а) Какова причина указанных различий между этими двумя ферментами в требовании к предшественникам?
б) В связи с вашим ответом на вопрос п. (а) укажите, какие другие различия между данными ферментами имеют отношение к затронутому вопросу.






ТЕМА 8. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ

Занятие 1-2. Лабораторно-практическое занятие «Углеводы. Количественное определение углеводов по Бьерри»
4 часа
Цель: экспериментально определить количественное содержание углеводов в растительном материале по методу Бьерри.
Оборудование: ступки с пестиками, мерные колбы с широким горлом вместимостью на 100 мл, мерные колбы на 100 мл, 500 мл, 1000 мл, воронки, пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10, 25 мл, водяные бани, пробирочные водяные бани, центрифужные пробирки, микробюретки, стеклянные палочки, электроплитки, центрифуги, термометр, весы, стеклянные пластинки для резки растительного материала, скальпели, кварцевый песок или измельченное стекло, терки пластмассовые, склянки для реактивов, бумажные фильтры, воздушные холодильники, секундомер, колбодержатели, промывалки, индикаторная бумага.
Реактивы: 10% Pb(CH3COO)2, 10% Na2SO4, 20% HCl, толуол, раствор сульфата меди (II) CuSO4.5H2O, щелочной раствор сегнетовой соли KNaC4H4O6.4H2O, жидкость Фелинга, раствор сульфата железа (III) Fe2(SO4)3, 0,05H KMnO4, CaCO3, Na2CO3.
Материалы: картофель, хлеб ржаной, апельсин, мандарин, груша, лимон, яблоко, виноград.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.309-338.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.155-164.
Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 302-323.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.140-150.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.297-367.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимо повторить формулы, особенности строения, изомерию и свойства углеводов, их классификацию, биологическую роль разных групп углеводов. Необходимы умения по записыванию формул важнейших альдоз и кетоз, изомеров; моносахаридов в виде формул Фишера, Хеуорза; формул отдельных дисахаридов, в частности сахарозы.
План занятия
I. Теоретический практикум.
II.Лабораторный практикум.
I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

Общая характеристика и классификация углеводов.
Редуцирующие и нередуцирующие сахара.
Химические свойства моносахаридов.
Хелаты, особенности строения.
Основной теоретический материал
Хелатные комплексы
Число связей, образуемых лигандом с комплексообразователем называют координационной емкостью или дентатностью лиганда (от лат. dentatus – зубчатый). Монодентатные лиганды образуют только одну связь с комплексообразователем и занимают одно координационное место (H2O, OH–, NH3, CN–, Cl– и т.д.). Бидентатные лиганды образуют две связи с комплексообразователем и занимают два координационных места (например, диметилглиоксим). Существуют тридентатные, тетрадентатные лиганды.
Полидентатные лиганды, благодаря наличию в них двух и более электронодонорных центров, способны образовывать несколько связей с ионами-комплексообразователями. При этом образуется устойчивая циклическая структура. Например, в результате взаимодействия этиленгликоля со свежеприготовленным гидроксидом меди(II) образуется комплексное соединение меди:

Ион комплексообразователя в таких соединениях оказывается как бы «захваченным в клешни» полидентатного лиганда, поэтому такие соединения получили название хелатных от греч. ch
·l
· - клешня.
Хелатные комплексные соединения – соединения, в которых  комплексообразователи связаны  с  полидентатными лигандами, причем атом или ион-комплексообразователь является компонентом циклической структуры. Лиганды, образующие хелатные циклы, называются хелатообразующими (хелатирующими). Хелатирующие реагенты содержат два типа электронодонорных центров:
А – группы (заместители I рода), содержащие подвижный атом водорода, например, -ОН, -NH2, -СООН, -ОН, -SO3H и т.д., при их координации к иону-комплексообразователю возможно замещение протона;
Б – группы (заместители II рода), содержащие нейтральные электроно- донорные группы, например,  -ОН, -NH2, =S, =NH и т.д.
Хелатные комплексные соединения отличаются высокой прочностью и устойчивостью. Причем, наиболее устойчивыми в комплексных соединениях являются пяти- и шестичленные циклы.    Частным случаем хелатных комплексов являются внутрикомплексные соединения.
            Внутрикомплексные соединения (ВКС) – координационные соединения металлов с бидентатными  лигандами, связанными с одним и тем же атомом металла-комплексообразователя через одну отрицательно заряженную и одну нейтральную донорные группы с образованием одинаковых или различных внутренних хелатных циклов. ВКС  не содержат внешнесферных ионов и не являются  электролитами. ВКС является, например, глицинат меди(II) (стр.16).



II.ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Приготовление реактивов.
Подготовка исследуемого материала к анализу

Приготовление реактивов
1. Раствор сульфата меди (II) CuSO4: 40г медного купороса (сульфата меди ч.д.а.) растворяют в дистиллированной воде, объем раствора доводят до метки в мерной колбе на 500мл и фильтруют.
Щелочной раствор сегнетовой соли: 150г гидроксида натрия NaOH (ч.д.а.) растворяют в дистиллированной воде, добавляют 200г сегнетовой соли KNaC4H4O6 . 4H2O, содержимое доводят до 500мл.
Жидкость Фелинга – смесь равных объемов раствора сульфата меди (II) CuSO4 и щелочного раствора сегнетовой соли KNaC4H4O6.4H2O. Готовят непосредственно перед употреблением.
Раствор сульфата железа (III) Fe2(SO4)3: 25г сульфата железа (III) или 50г железоаммонийных квасцов растворяют в дистиллированной воде, добавляют 100г (54,4мл) концентрированной серной кислоты. Раствор не должен обладать восстанавливающими свойствами, поэтому к нему по каплям приливают KMnO4 до появления чуть слабого розового оттенка. Затем общий объем раствора доводят до 500мл.

2.Подготовка исследуемого материала к анализу
Обработка анализируемого материала перед определением углеводов необходима для экстракции исследуемых веществ, а также удаления из полученной вытяжки веществ, мешающих их определению (белки, «редуцирующие несахара» и др.). Анализ проводится в трехкратной повторности.
Анализируемый материал следует, прежде всего, измельчить: зерно и другие сухие продукты размалываются, плоды и овощи мелко нарезаются на стекле или даже растираются на терке.
Из измельченного и перемешанного материала берется навеска 1-2г. Навеска растирается в ступке с 1-2г кварцевого песка и 0,2-0,3г СаСО3 (для нейтрализации органических кислот, которые могут вызвать гидролиз сахарозы) до однородного, пастообразного состояния.
Затем растертая навеска переносится количественно (т. е. без потерь!) с помощью воронки, стеклянной палочкой и промывалки с водой в мерную колбу на 100 мл. На этот этап работы следует обратить особое внимание, выполнять его с большой тщательностью, т. к. здесь легко может произойти потеря части навески. Из ступки в воронку материал надо переносить по частям, а не весь сразу, проталкивая его палочкой в широкую часть колбы; при сливании жидкой части материала носик ступки плотно прижать к палочке держа последнюю отвесно над воронкой. Пестик, ступку, палочку, воронку несколько раз промывают горячей дистиллированной водой из промывалкп, выливая смывные воды в ту же мерную колбу. Всего воды в колбу прилить следует столько, чтобы вместе с перенесенным материалом она занимала 1/2 или 2/3 объема колбы.
После этого колба ставится на 30мин. в кипящую водяную баню (при перемешивании через каждые 5-7мин.) для экстрагирования углеводов.
Через 30мин. колба охлаждается под краном, и в нее приливают до полноты осаждения 10% раствор уксуснокислого свинца для осаждения белков и «редуцирующих несахаров». Обычно на навеску 1-2г плодов и овощей требуется 3-5мл уксуснокислого свинца.
Перемешивают содержимое колбы, дают отстояться 1015 минут. Избыток уксуснокислого свинца мешает определению углеводов, поэтому удаляют его путем осаждения сульфатом натрия, 10% раствора которого следует прилить 5-10мл (избыток сульфата натрия не мешает определению).
В колбу приливается вода до метки. Содержимое перемешивается и отстаивается. Идет реакция:
Pb(CH3COO)2 + Na2SO4 PbSO4 + 2CH3COONa

Обычно на этом этапе в работе делается перерыв на несколько часов или до следующего дня. В этом случае в колбы следует добавить 3-5 капель толуола (в качестве антисептика) и поставить их в холодильник.




Занятие 3-4. Лабораторно-практическое занятие «Количественное определение углеводов по Бьерри» (продолжение)
4 часа
Цель: экспериментально определить количественное содержание углеводов по методу Бьеррри.
Оборудование: ступки с пестиками, мерные колбы с широким горлом вместимостью на 100 мл, мерные колбы на 100 мл, 500 мл, 1000 мл, воронки, пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10, 25 мл, водяные бани, пробирочные водяные бани, центрифужные пробирки, микробюретки, стеклянные палочки, электроплитки, центрифуги, термометр, весы, стеклянные пластинки для резки растительного материала, скальпели, кварцевый песок или измельченное стекло, терки пластмассовые, склянки для реактивов, бумажные фильтры, воздушные холодильники, секундомер, колбодержатели, промывалки, индикаторная бумага.
Реактивы: 10% Pb(CH3COO)2, 10% Na2SO4, 20% HCl, толуол, раствор сернокислой меди CuSO4.5H2O, щелочной раствор сегнетовой соли KNaC4H4O6 . 4H2O, жидкость Фелинга, раствор сульфата железа (III) Fe2(SO4)3, 0,05H KMnO4, CaCO3, Na2CO3.
Материалы: картофель, хлеб ржаной, апельсин, мандарин, груша, лимон, яблоко, виноград.

Основная литература:
1.Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.309-338.
2.Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.155-164.
3.Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 302-323.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.140-150.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.297-367.

Методические рекомендации к занятию
Для выполнения лабораторного практикума необходимы знания о сущности и особенностях перманганатометрии; умения по записи уравнений реакций, лежащих в основе метода определения, расстановке коэффициентов в ОВР методом полуреакций
План занятия
I. Теоретический практикум.
II.Лабораторный практикум.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
1. Сущность метода Бьерри.
2. Уравнения реакций, лежащих в основе работы.
Сущность перманганатометрии.

Основной теоретический материал
Метод Бьерри предназначен для определения редуцирующих углеводов в растительном материале. Растворимые углеводы в том или ином количестве находятся в любом органе растения. Широко распространены в основном три углевода – глюкоза, фруктоза и сахароза, редко – другие сахара.
Принцип метода
Сахара, имеющие свободные альдегидные или кетонные группы, обладают способностью в определенных условиях восстанавливать щелочные растворы оксида меди (II) до оксида меди (I), который может быть учтен весовым или объемным путем. Последний способ, предложенный Бертраном, получил широкое распространение. Микрометод Бьерри является модификацией метода Бертрана:

Cu(OH)2 + углеводы Cu2O + продукты окисления углеводов (I).

Осадок оксида меди (I) после промывания водой обрабатывается подкисленным серной кислотой раствором сульфата железа (III). При этом окисленное железо восстанавливается, а оксид меди (I) превращается в оксид меди (II):
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
Количество восстановленного железа учитывается титрованием раствора перманганата калия:

10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

Таким образом, будет иметь место следующая цепочка количественной зависимости: чем больше углеводов, тем больше образуется оксида меди (I), и тем больше железа (III) превратиться в железо (II), а, следовательно, и больше перманганата калия пойдет на титрование. Однако надо иметь в виду, что в реакции углеводов с жидкостью Фелинга участвует не гидроксид меди (II), а внутрикомплексное хелатное соединение, образующееся при взаимодействии гидроксида меди (II) с тартратом калия-натрия (сегнетовой солью). В этом большое преимущество реакции Фелинга по сравнению с реакцией Троммера (с щелочным раствором гидроксида меди (II)), т.к. исключается возможность выпадения черного осадка оксида меди (II) при сильном нагревании.

II.ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Определение редуцирующих углеводов.
Определение общего количества углеводов.

Определение редуцирующих углеводов
Содержимое колбы с предыдущего занятия отфильтровывают в коническую колбу и уже непосредственно приступают к количественному определению углеводов.
1. Для определения редуцирующих сахаров в центрифужные пробирки вносят по 4 мл фильтрата.
Добавляют туда по 4 мл жидкости Фелинга, после чего содержимое перемешивают, постукивая по кончику пробирки (жидкость должна быть голубой; если цвет ее стал бурый, это означает, что не хватило жидкости Фелинга).
Пробирки ставят на 10 мин. на кипящую водяную баню; по истечении этого времени выпадает красно-бурый осадок закиси меди.
Пробирки охлаждают в воде, после чего содержимое пробирок центрифугируют в течение 4-5 мин. При 1500 об/мин.
Жидкость с осадка декантируют, и край пробирки подсушивают фильтровальной бумагой. Необходимо следить, чтобы осадок не сливался.
Сразу после сливания жидкости к осадку добавляют 2мл горячей дистиллированной воды и осадок встряхивают, постукивая пальцем по концу пробирки.
К содержимому добавляют 6-8мл горячей дистиллированной воды, обмывая ею стенки пробирки.
Пробирки с содержимым снова центрифугируют, жидкость затем сливают. Осадок промывают водой 2-3 раза. После каждого центрифугирования смотрят, нет ли на поверхности жидкости частиц закиси меди. Если частицы ее плавают на поверхности, то в пробирки добавляют 8-10 капель этилового спирта, жидкость встряхивают и снова центрифугируют.
После промывания осадка в пробирки немедленно приливают 2мл горячей дистиллированной воды (чтобы закись меди не соприкасалась с воздухом).
К взмученному палочкой осадку приливают 3мл раствора сульфата железа (III) Fe2(SO4)3, продолжая помешивать палочкой до полного растворения осадка закиси меди (палочку оставляют в пробирке). Раствор в пробирке становится зеленоватым.
Не вынимая палочки, раствор титруют из микробюретки до бледно-розового окрашивания 0,05н раствором КМnО4.
Параллельно ставят контроль. Для этого вместо испытуемого гидролизата берут 4мл дистиллированной воды. Ход дальнейшей работы тот же, что и с фильтратом.
Содержание редуцирующих сахаров рассчитывают по формуле:

13 EMBED Equation.3 1415, где

X - содержание редуцирующих сахаров с мг проц.;
a – объем раствора КМnО4, пошедший на титрование испытуемой пробы (мл);
b - объем раствора КМnО4, пошедший на титрование контрольной пробы (мл);
T KMnO4/Cu = 13 EMBED Equation.3 1415(г/мл)
(г/мл) показывает, сколько г Cu соответствует 1мл раствора КМnО4;
Vколбы - общий объем водного экстракта;
К – коэффициент перевода меди в сахар (1 кг глюкозы (редуцирующих cахаров) соответствует 1,77мг меди);
m навески – масса навески растительного материала (г);
V пробы - объем фильтрата, взятый в центрифужную пробирку для анализа.

Определение общего количества углеводов

Для определения общего количества сахара анализ проводят точно так же, как описано в п.1, только в центрифужные пробирки берут по 4мл гидролизата, а не фильтрата, как это было в случае определения редуцирующих сахаров.
Для определения общего количества сахаров (моносахариды + сахароза) берут 25мл фильтрата в конические колбы на 100мл, 3 мл 20% раствора НСl, закрывают пробками с воздушными холодильниками и проводят 30-минутный гидролиз на кипящей водяной бане. Гидролизат охлаждают и нейтрализуют сухой содой, контролируя завершение нейтрализации с помощью индикаторной бумажки. Если выпадает осадок, гидролизат отфильтровывают.
Для расчета содержания общего количества сахара (моносахариды + сахароза) пользуются той же формулой, но К (коэффициент перевода меди в сахарозу) будет равен 1,90 мг.
Для определения содержания сахарозы нужно вычесть содержание редуцирующих cахаров из содержания общего количества сахара.

Вопросы для самопроверки
На чем основан метод определения углеводов в растительном материале по Бертрану?
В чем преимущество метода Бьерри по сравнению с методом Бертрана?
Что такое внутрикомплексные соединения, хелаты?
Написать уравнения всех реакций, лежащих в основе количественного определения углеводов по Бьерри.
Количество восстановленного железа учитывается перманганатометрическим методом. Дать характеристику этого метода.
Каковы условия проведения перманганатометрических определений?
Как устанавливается точка эквивалентности в перманганатометрии?
Что такое декантация?
В чем смысл контрольного опыта?
Что означает титр рабочего раствора по определяемому веществу?
По какой формуле рассчитывается титр рабочего раствора по определяемому веществу?
Как найти эквивалентную массу окислителя, восстановителя?
Чему равна эквивалентная масса меди?
Какой метод и способ титрования применяли при определении углеводов по Бьерри.
Способны ли восстанавливать реактив Фелинга: D-рибоза, 2-дезокси-D-рибоза, D-фруктоза, D-глюкоза. Напишите структурную формулу реактива Фелинга и уравнение реакции окисления им одной из альдоз (до альдоновой кислоты).





Занятие 5-6. Семинар «Пути дыхательного обмена»
4 часа
Цель: изучить сущность, виды и основные этапы обмена углеводов, их особенности и значение данных процессов для организма; рассмотреть механизмы регуляции метаболизма углеводов.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.344-363, С.389-417.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.43-76.
3. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985. – Т2-С.439-546.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.; Т2 – С.127-136,С. 172-194.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.335-360.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания о сущности и особенностях дыхания и брожения, сущности и особенностях апотамического пути дыхания, ферментах, катализирующих данные процессы, об основных этапах дыхательного процесса, о его биологическом значении. Необходимы умения по записи уравнений химических реакций, лежащих в основе процессов обмена углеводов, расчета энергетического баланса брожения и дыхания, сравнении дихотомического и апотамического путей.
План занятия
Теоретический практикум.
Решение задач.
I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ.

Вопросы для семинара
Углеводный обмен: основные пути, особенности протекания, энергетика.
Биологическое окисление.
Общая характеристика анаэробного и аэробного дыхания.
Гликолиз - анаэробная фаза дыхания: химизм, энергетика.
Гликогенолиз.
Особенности спиртового и молочнокислого брожения, их химизм.
Цикл Кребса.
Окислительное фосфорилирование.
Энергетический баланс аэробного дыхания.
Апотамический путь дыхания.
Глиоксилатный цикл, его связь с ЦТК, глюконеогенезом, липидным обменом.
Обмен углеводов у человека и животных. Превращение углеводов и всасывание продуктов распада в пищеварительном тракте.
Регуляция углеводного обмена.
Изучение вопросов «Дыхание. Брожение» в школьном курсе биологии.

Частные вопросы к теоретическому практикуму
«Пути дыхательного обмена»
1. Что такое биологическое окисление? Вклад русских и советских ученых в развитие современных представлений о механизмах биолог, окисления.
2. Дать характеристику типам биологического окисления: свободное окисление, окисление сопряженное с фосфорилированием.
3. Что такое гликолиз? Брожение? Дыхание?
4. Составьте суммарное уравнение реакции гликолиза.
5. Перечислить, к каким классам и подклассам относятся ферменты гликолиза.
6. Какие реакции гликолиза являются пусковыми? Почему?
7. Как понимать, что глюкозо-6-фосфат является аллостерическим ингибитором фермента гексокиназы?
8. Как объяснить тот важный факт, что все девять промежуточных продуктов на пути от глюкозы до пирувата представляют собой фосфорилированные соединения?
9. Что такое АТФ, АДФ? Какова химическая природа этих соединений и какова их роль в процессе гликолиза.
10.. Какой фермент расщепляет
·-1,6-гликозидные связи в амилопектине?
11. Какие амилазы расщепляют
·-1,4-гликозидные связи в молекуле коахмала.
12. Какая амилаза расщепляет
·-1,6-гликозидные связи в молекуле крахмала?
13. Перечислите основные виды брожения. Укажите их использование в промышленности.
14. Составьте суммарное уравнение реакции спиртового брожения.
15. Какие конечные соединения образуются при гликолизе и спиртовом брожении?
16. Перечислите дегидрогеназные реакции спиртового брожения. Укажите субстрат, продукт, фермент.
17. Почему процесс распада глюкозы до молочной кислоты называется анаэробным процессом?
18. В присутствии каких ферментов осуществляется превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат?
19. В присутствии каких компонентов происходит превращение фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат?
20. Какой фермент катализирует перенос фосфатной группы от ФЕПВК на АДФ с образованием ПВК?
21. Какой фермент катализирует распад фруктозо-1,6-дифосфата на две триозы.
22. Какой процесс называется гликогенолизом и в чем отличие от процесса гликолиза?
23. Какая связь существует между брожением и дыханием?
21. Какова судьба пировиноградной кислоты в организме в анаэробных и аэробных условиях? Ответ подтвердите соответствующими уравнениями реакций.
24. Приведите схему аэробной фазы распада пировиноградной кислоты в организме с указанием ферментов, катализирующих этот процесс.
25. В присутствии какого или каких коферментов осуществляется окислительное декаброксилирование пировиноградной кислоты?
26. Какое соединение образуется в результате окислительного декарбоксилирования ПВК в аэробных условиях?
27. Перечислите ферменты, принимающие участие в цикле Кребса и относящиеся к классу оксидоредуктаз.
28. Для каждого из ферментов цикла Кребса укажите класс и подкласс.
29. Каков энергетический эффект ЦТК?
30. Что такое субстратное фосфорилирование? Привести примеры. В чем значение этого процесса для живого организма?
31. Какая реакция в цикле Кребса сопряжена с синтезом ГТФ?
32. Характеристика цепи переноса электронов (дыхательной цепи).
33. В каких точках дыхательной цепи и почему происходит генерирование энергии в виде макроэргических связей АТФ?
34. Что понимают под окислительным фосфорилирораннем? Каков механизм окислительного фосфорилирования? Какова роль этого процесса для организма?
35. Каков энергетический баланс дыхания?
36. Обосновать уравнениями химических реакций энергетический баланс процесса дыхания.
37. Используется ли в процессах жизнедеятельности вся энергия, высвобождаемая при дыхании?
38. Почему при дыхании в аэробных условиях выход энергии намного больше чем при брожении?
39. Чем отличается апотомический путь распада от дихотомического?
40. Для каких клеток, органов характерен апотомический путь расщепления глюкозы?
41. Каково назначение, функция апотомического пути расщепления глюкозы?
42. Дать синонимы понятия «апотомический путь расщепления глюкозы».
43. Приведите схему апотомического распада Д-глюкозы. Каково соотношение в организме дихотомического и апотомического путей распада углеводов?
44. Как вы понимаете «АТФ универсальная энергетическая валюта в биологических системах?»
45. Характеристика глиоксилатного цикла. Значение этого цикла.
II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ

1. Определите число молекул АТФ, синтезированных при:
а) дихотомическом пути распада молекулы глюкозо-6-фосфата до ПВК;
б) спиртовом брожении одной молекулы глюкозы;
в) гликолизе, если в реакцию вовлекается 1 молекула глюкозы;
г) окислительном декарбоксилировании одной молекулы ПВК;
д) полном окислении 5 молекул глюкозы по дихотомическому пути.
2. Рассчитайте сколько молей АТФ синтезируется при окислительном фосфорилировании из 1г глюкозы.
3. Человек в сидячем положении потребляет в течение 10 сек. около 50мл кислорода, спринтер, соревнуясь в беге на 100м, за то же время потребляет 1л кислорода. Пробежав дистанцию, спринтер продолжает тяжело дышать еще несколько минут, потребляя при этом по сравнению со спокойно сидящим человеком дополнительно около 4л кислорода. Почему потребность в кислороде резко возрастает при беге на короткую дистанцию? Почему повышенная потребность в кислороде сохраняется после бега?
4. При напряженной работе мышц ткань потребляет гораздо больше АТФ, чем в состоянии покоя. В скелетных мышцах, например, ног кролика или мышцах крыла индейки почти весь АТФ образуется в процессе гликолиза (анаэробный или гликолизный тип дыхания). Представим, что в скелетной мышце отсутствует лактатдегидрогенназа. Могла бы мышца в этом случае напряженно работать, т. е. генерировать энергию АТФ путем гликолиза? Аргументируйте свой ответ.
5. Напишите ряд последовательных реакций, которые позволят определить число молекул АТФ, расходуемых на превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат. Какую часть это число составит от максимального числа молекул АТФ, образующихся при полном расщеплении глюкозо-6-фосфата?
6. Сколько граммов сахарозы нужно подвергнуть гидролизу, чтобы из образующейся при этом глюкозы получить 27г молочной кислоты, если молочно-кислое брожение протекает с выходом 50 проц. от теоретического.
7. При сбраживании 250г глюкозы получено 100г этилового спирта. Какой это процент от теоретически возможного?
8. Напишите уравнение реакции полного гидролиза крахмала и рассчитайте количество глюкозы, которое можно получить из 1т картофеля, содержащего 20 проц. крахмала, если выход глюкозы составляет 70 проц. теоретически возможного.
9. Сколько граммов глюкозы было подвергнуто спиртовому брожению, протекающему с выходом 80 проц., если для нейтрализации образовавшегося при этом оксида углевода (IV) потребовалось 65,57мл 20 проц. водного раствора гидроксида натрия (
· = 1,22 г/см3). Сколько граммов гидрокарбоната натрия при этом образовалось?




Задания для контроля и самоконтроля знаний
1. Изобразите схему распада Д-глюкозы в процессе молочнокислого брожения с приведением соответствующих уравнений реакций и указанием ферментных систем, принимающих участие в этом процессе.
2. При анаэробном расщеплении углеводов глюкоза в процессе последовательных реакций превращается в молочную кислоту. Напишите уравнения всех реакций, происходящих в этом процессе, и подсчитайте, сколько молекул АТФ вступило в реакции и сколько вновь их образовалось.
3. Напишите уравнения реакций спиртового брожения.
4. Приведите схему спиртового брожения, взяв в качестве исходного углевода сахарозу.
5. Напишите уравнение реакции превращения ПВК в молочную кислоту. Укажите фермент, осуществляющий это превращение.
6. Составьте схему превращения 3-ФГК в ПВК. Назовите ферменты, принимающие участие в этом превращении.
7. Напишите уравнения реакций фосфорилирования галактозы при участии соответствующей киназы и дальнейшего перехода фосфорного эфира галактозы во фруктозо-6-фосфат. Дайте полное название метаболитов и ферментов, ускоряющих эти реакции.
8. Фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат, глюкозо-6-фосфат, 3-фосфоглицериновая кислота (3-ФГК), ФДА, 3-ФГА, 2-ФЕПВК, 2-ФГК. Поставьте эти соединения в порядке их превращения по схеме дихотомического пути распада глюкозо-6-фосфата.
9. Составьте схему гликогенолиза с указанием ферментов, принимающих участие в этом процессе.
10. Назовите соединения, образующиеся при альдолазном расщеплении фруктозо-1,6-дифосфата. Напишите уравнение реакции.
11. Какой фермент ускоряет реакцию образования глюкозо-1-фосфата из гликогена:
12. Какими реакциями отличается гликолиз от спиртового брожения? Приведите уравнения этих реакций.
13. Составьте, включая необходимые процессы фосфорилирования, суммарные уравнения реакций:
а) Д-фруктоза молочная кислота;
б) глюкозо-1,6-дифосфат этанол + оксид углерода (IV).
14. Сравнить пути гликолиза и гликогенолиза.
15. Напишите суммарное уравнение превращения ПВК в СО2.
16. Составьте суммарное уравнение реакций цикла Кребса.
17. Рассчитайте число молей АТФ, образующихся при биологическом окислении малата в ЩУК.
18. Рассчитайте число молей АГФ, образующихся при превращении
·-кетоглутаровой кислоты в янтарную.
19. Напишите уравнения реакций фосфорилирования АДФ на уровне субстрата при распаде моносахаридов по дихотомическому пути.
20. Напишите уравнения реакций цикла Кребса, ускоряемые аконитатгидратазой (аконитазой).
21. Напишите уравнения реакций превращения изолимонной кислоты в сукцинил-КоА. Назовите ферменты этого превращения.
22. Перечислите ферменты, принимающие участие в дихотомическом пути распада глюкозо-6-фосфата и относящиеся к классу лиаз. Составьте соответствующие уравнения реакций.
23. Перечислите ферменты, принимающие участие в дихотомическом пути распада глюкозо-6-фосфата и относящиеся к классу изомераз. Составьте уравнения реакций.
24. Приведите схему дихотомического распада Дглюкозы. Ответ иллюстрируйте формулами с указанием ферментов, принимающих участие в этом процессе.
25. Укажите дегидрогеназные реакции цикла Кребса. Отметьте субстрат, продукт, фермент.
26. Рассчитайте число молей АТФ, образующихся при биологическом окислении янтарной кислоты в ЩУК.
27. Рассчитайте число молекул АТФ, образующихся при биологическом окислении янтарной кислоты в яблочную.
28. На каких этапах в ЦТК осуществляется реакция декарбоксилирования? Назовите ферменты. Ответ иллюстрируйте уравнениями реакций.
29. Составьте схему превращения
·-кетоглутаровой кислоты в янтарную. Назовите ферменты.
30. Рассчитайте число молей АТФ, образующихся при биологическом окислении
·-кетоглутаровой кислоты в фумаровую.
31. Составьте суммарное уравнение реакции фосфоролиза амилозы.
32. Напишите уравнение реакции гидролиза крахмала.
33. Напишите уравнение реакции фосфоролиза крахмала.



Занятие 7-8. Семинар «Биосинтез углеводов»
4 часа
Цель: изучить сущность, особенности и значение процессов биосинтеза углеводов в растительных и животных организмах данных процессов для организма; рассмотреть вопросы регуляции данных процессов.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
1.Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.279-310.
2. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985. – Т2-С.683-715.
3.Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. – Москва.: Мир, 1986. – С.310 - 340.
Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания о сущности, особенностях и основных этапах процессов биосинтеза углеводов в растительных и животных организмах, ферментах, их катализирующих, об их биологическом значении. Необходимы умения по записи уравнений химических реакций, лежащих в основе процессов биосинтеза углеводов, темновой стадии фотосинтеза, глюконеогенеза, гликогенонеогенеза.
План занятия
I. Теоретический практикум.
II.Решение задач.
I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ.
1. Фотосинтез, общая характеристика.
2. Пигменты, участвующие в фотосинтезе.
3. Фотофизическая и фотохимическая стадии фотосинтеза.
4. Фотофосфорилирование.
5. Биохимическая стадия фотосинтеза. Цикл Кальвина.
6. С-3 путь фотосинтеза.
7. С-4 путь фотосинтеза.
8. Синтез дисахаридов.
9. Синтез полисахаридов.
10. Глюконеогненз.
11. Гликогенонеогенез.

Частные вопросы к теоретическому практикуму
«Биосинтез углеводов»
1. Дайте краткую, историческую справку об открытии процесса фотосинтеза. Работы К. А. Тимирязева.
2. Дайте характеристику автотрофных и гетротрофных организмов. Какие организмы способны к фотосинтезу?
3. В чем суть фотосинтеза? Фоторедукции? В чем сходство и различие между этими процессами?
4. Какие соединения могут быть в качестве акцептора водорода, электронов? Привести примеры. Какие соединения могут быть в качестве донора водорода, электронов?
5. Запишите классическое уравнение процесса фотосинтеза. Каково происхождение кислорода, выделяемого в процессе фотосинтеза?
6. Выделяется ли кислород в процессе бактериального фотосинтеза (фоторедукции)? Запишите основное уравнение процесса бактериального фотосинтеза.
7. Охарактеризуйте фотофизический этап фотосинтеза.
8. Дайте характеристику химического строения пигментам фотосинтеза (хлорофиллам, каротиноидам, фикобилинам).
9. Охарактеризуйте фотохимический этап фотосинтеза.
10. Какие фотосистемы принимают участие в фотосинтезе? Охарактеризуйте их.
11.Что такое фотосинтетическое фосфорилирование: циклическое, нециклическое? С чем связано такое подразделение?
12.Запишите суммарное уравнение процесса циклического фотофосфорилирования.
13.Запишите суммарное уравнение процесса нециклического фотофосфорилирования.
14. Запишите уравнение фотолиза воды.
15. Каков итог фотохимической стадии?
16. Охарактеризуйте биохимический этап фотосинтеза. Цикл Кальвина.
17. Укажите место стыка между световыми и темновыми реакциями.
18. Объясните циклический и разветвленный характер фотосинтеза.
19. Как объяснить, что все промежуточные продукты цикла Кальвина - фосфаты сахаров?
20. ФГА первый сахар - триоза, появляющийся в процессе фотосинтеза. Какова его дальнейшая судьба?
21. Назовите трансальдолазные и транскетолазные реакции в цикле Кальвина.
22. Укажите, к каким классам относятся ферменты цикла Кальвина. Где локализованы ферменты цикла Кальвина?
23. На каком этапе первичного биосинтеза углеводов и каким образом расходуется АТФ.
24. Запишите суммарное уравнение цикла Кальвина.
25. Что такое С3растения, СЗпуть фотосинтеза?
26. Что такое С4растения, С4путь фотосинтеза?
27. Поясните фразу «фотосинтез имеет поистине космическое значение».
28. Современные работы по искусственному фотосинтезу.
29. Чему равен КПД фотосинтеза?
30. Как осуществляется синтез других моносахаридов (маннозы, галактозы и др.) в растениях?
31. Что представляют реакции трансгликозилирования?
32. Как осуществляется синтез дисахаридов (сахарозы)?
33. Синтез гликогена.
35. Синтез крахмала.
36. Синтез целлюлозы.
37. В чем состоят особенности биосинтеза моносахаридов у гетеротрофов по сравнению с автотрофами?
38. Почему биосинтез глюкозы у всех животных абсолютно необходимый процесс?
39. Сколько граммов глюкозы в сутки потребляет мозг человека? Какова суточная потребность организма человека в глюкозе?
40. Что такое глюконеогенез? Назовите субстраты глюконеогенеза?
41. Является ли глюконеогенез обращением гликолиза?
42. Какие реакции глюконеогенеза общие с процессом гликолиза?
43. Какие реакции гликолиза необратимы и потому не могут использоваться в глюконеогенезе?
44. Дать схему реакций процесса глюконеогенеза.
45. Написать суммарное уравнение глюконеогенеза.

II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
1. Предположим, что в освещаемой суспензии хлореллы активно идет фотосинтез, когда свет внезапно выключился. Как изменится в следующую минуту содержание 3-ФГК и рибулезо-1,5-дифосфата?
2. Предположим, что в освещаемой суспензии хлореллы активно протекал фотосинтез в присутствии 1 % С02, когда концентрация СО2 внезапно снизилась до 0,003 %. Какое действие должно было оказать это снижение на содержание 3-ФГК и рибулозо-1,5-дифосфата в следующую минуту?
3. Фотосинтезирующий аппарат сине-зеленой водоросли содержит помимо хлорофилла большие количества фикоэритрина и фикоцианина. Максимум поглощения фикоэритрина находится в области между 480 и 600 нм, фикоцианина 620 нм. Выскажите предположение о роли этих дополнительных пигментов фотосинтеза.
4. При освещении зеленого растения светом с длиной волны 680 или 700 нм скорость фотосинтеза, измеряемая по выделению кислорода, в первом случае оказывается выше. Однако освещение растения светом с той и другой длиной волны одновременно обеспечивает более высокую скорость фотосинтеза, чем освещение каждым светом в отдельности. Объяснить причину этого.
5. Если освещать растение кукурузы в присутствии газообразной 14 СО2, то уже примерно через 1 сек. свыше 90% всей радиоактивности, включенной в листьях, обнаруживается в С-4 малата, аспартата, оксалоацетата. С С-1,3-фосфоглицерата 14C появляется лишь по истечении 60сек. объясните эти результаты.
6. Если суспензию зеленых водорослей сначала освещать в отсутствии О2, а затем инкубировать с 14СО2 в темноте, то в течение короткого промежутка времени наблюдается превращение 14СО2 в 14Сглюкозу. Что нам говорит это наблюдение о двух фазах фотосинтеза? Почему превращение 14СО2 в 14Сглюкозу быстро прекращается?
7. У пурпурных серных бактерий при освещении может идти фотосинтез в присутствии Н2О и 14СО2, но только и том случае, если имеется сероводород, а кислород отсутствует, в ходе фотосинтеза сероводород превращается в элементарную серу, а кислород не выделяется. Какую роль играет превращение сероводорода в серу? Почему не выделяется кислород?
8. Чтобы определить, может ли то или иное соединение; служить предшественником глюкозы, поступают следующим образом; оставляют сначала животное голодать, пока у него не истощится запас гликогена в печени, а потом дают ему исследуемое соединение. Те соединения, под влиянием которых количество гликогена в печени увеличивается, принято называть глюкогенным, потому что они сначала превращаются в глюкозо-6-фосфат. Покажите на основе известных ферментативных реакций, какие из ниже названных соединений являются глюкогенными: 1) сукцинат, 2) глицерол, 3) ацетил-КоА, 4) пируват, 5) бутират, б) гидрокарбонат-ион.
9. Скорость роста бамбука.
Стебли тропической травы бамбука при оптимальных условиях могут расти феноменально быстро (примерно 30см в день). Рассчитайте, сколько сахарных остатков в секунду должно ферментативно присоединяться к растущим целлюлозным цепям при такой скорости роста, если принять, что стебли бамбука почти целиком состоят из целлюлозных волокон, ориентированных по направлению роста. Длина каждого остатка Дглюкозы в молекуле целлюлозы составляет приблизительно 0,45 нм.

Задания для контроля и самоконтроля знаний
1. Напишите уравнение реакции превращения 3-ФГК в 3-ФГА в процессе первичного биосинтеза углеводов.
2. Составьте схему превращения 3-ФГА в глюкозо-6-фосфат в процессе первичного биосинтеза углеводов.
3. Составьте схему превращения ФДА во фруктозо-6-фосфат. Каково биологическое значение процесса фосфорилирования свободных моносахаридов? Напишите уравнение реакции, катализируемой гексокиназой.
4. При действии какого фермента осуществляется реакция.
АТФ +глюкоза АДФ + глюкоза-6-фосфат
Напишите уравнение реакции.
5. Напишите структурные формулы продуктов реакции и исходных соединений в приведенном уравнении реакции:
УДФгалактоза + Дглюкоза х+у, если она осуществляется при участии фермента УДФгалактоза:Д-глюкоза - 4 -галактозилтрансфераза.
6. Написать уравнение реакции, катализируемой ферментом УДФ-глюкоза:Д-фруктозо-6-фосфат-2-гликозилтрансфераза.
7. Напишите структурные формулы продуктов реакции, исходных веществ в приведенном уравнении реакции
УДФ-глюкоза + Д-глюкозо-6-фосфат X + Y
Фермент реакции:
УДФ-глюкоза:Д-глюкозо-6-фосфат-4-гликозилтрансфераза
8. Напишите структурные формулы продуктов реакции и исходных соединений в приведенном уравнении реакции:
УДФглюкоза+ гликоген Х+У,
если ее ускоряет фермент:
УДФглюкоза:гликоген-1,4-глюкозилтрансфераза.
9. Написать уравнение реакции, катализируемой ферментом:
УДФ-Д-глюкоза: Д-глюкоза-4 -гликозилтрансфераза.
10. В послеродовый период с начала лактации, активность фермента лактозосинтазы резко возрастает, что приводит к образованию молочного сахара (лактозы). Написать уравнение реакции образования лактозы, если донором галактозных остатков является УДФ-Д-галактоза.
11. Напишите формулы уридиндифосфатглюкозы и гуанозиндифосфат- глюкозы. В чем состоит роль этих соединений в биосинтезе олиго- и полисахаридов?
ТЕМА 9. ОБМЕН ЛИПИДОВ

Занятие 1-2. Лабораторно-практическое занятие
«Физико – химические свойства жиров»
4 часа
Цель занятия: экспериментально определить основные физико-химические показатели жиров.
Оборудование: весы аналитические, пробирки стеклянные химические, пипетка градуированная на 10мл, колбы конические на 250мл с пробками, бюретка с краном на 25мл, цилиндр мерный на 100мл, ареометры; колба коническая на 50мл или 100мл, цилиндры мерные на 10мл или 25мл, пипетки с одной меткой на 1мл или 2мл; баня водяная, колбы конические на 50мл с обратными холодильниками, пипетки с одной меткой на 1 мл.
Реактивы: растительное масло, спирт этиловый, раствор йода 0,2н в спирте (25,4г свежевозогнанного йода переносят в мерную колбу на 1000 мл и растворяют в спирте), 0,1н гипосульфит, 0,5% крахмал; смесь спирта с серным эфиром (для нейтрализации к смеси спирта и эфира (1:1) прибавляют 3-4 капли фенолфталеина и затем 0,1н спиртовой раствор гидроксида калия по каплям, до появления слабого розового окрашивания), 0,1н КОН в 96% спирте, масло растительное или жир животный; 0,5н гидроксид калия в 96% спирте, 0,5н соляная кислота (титрованная), 1% фенолфталеин.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.420-470.
Грин Н. Биология в 3-х томах / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. – М.: Мир, 1993.- С.16-170.
Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т1 – С. 325-352.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.151-164.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.370-379.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к занятию необходимо повторить формулы жиров, их строение и свойства, необходимы знания физико-химических показателей жиров. Для лабораторного практикума необходимы знания особенностей и сущности йодометрии, метода нейтрализации.
План занятия
I. Теоретический практикум.
II.Лабораторный практикум.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
1. Жиры, особенности состава, свойства.
2. Основные физико-химические показатели жиров (йодное число, число омыления, эфирное и кислотное числа).
3. Уравнения реакций, лежащих в основе работы.
4. Сущность и особенности йодометрии.
5. Сущность и особенности метода нейтрализации.

Основной теоретический материал
Сущность и характеристика йодометрии
По простоте и точности йодометрический метод считается одним из лучших методов в титриметрическом анализе. Йодометрические методы анализа основаны на реакциях, в ходе которых образуется или расходуется свободный йод:
I2 + 2
· 2I-
2I- - 2
· I2
Е I2/2I- = 0,54В.
Их делят на две категории. К первой относятся методы, основанные на титровании легко окисляющихся веществ (восстановителей) стандартным раствором йода. Эти титрования прямым или обратным способом находят ограниченное применение, поскольку йод – относительно слабый окислитель.
Йодометрическое определение окислителей основано на титровании заместителя, на применении стандартного раствора тиосульфата натрия для титрования йода, выделявшегося при взаимодействии окислителя с избытком йодида калия. Количество образовавшегося йода химически эквивалентно количеству окислителя и поэтому служит основой анализа. В качестве рабочих растворов применяют растворы йода и тиосульфата натрия.
Растворимость йода в воде невелика (2.10-3 моль/л), поэтому его титрованные растворы готовят растворением точной навески свободного йода в концентрированном растворе йодида калия. При этом образуется комплексная соль KI3, легко растворимая в воде. Исходное вещество I2 получается из продажного химически чистого реагента путем возгонки.
Можно приготовить раствор йода приблизительно нужной концентрации и стандартизировать его.
Растворы йода малоустойчивы, так как они летучи, медленно действуют на резиновые и корковые пробки и другие органические вещества.
Концентрация раствора йода может меняться за счет окисления йодид-ионов кислородом воздуха:
4I- + О2 + 4Н+ I2 + 2 Н2О
Этот процесс ускоряется на свету, при нагревании и в присутствии кислот. Поэтому растворы йода хранят на холоде, в склянках из темного стекла и защищенными от соприкосновением с кислородом воздуха.
Раствор тиосульфата натрия Na2S2O3.5H2O не отвечает требованиям, предъявляемым исходным веществам, так как:
реагирует с оксидом углерода (IV) воздуха или растворенными в воде:
S2O32- + Н2О + СО2 НСО3- + НSO3- + S
окисляется кислородом воздуха:
S2O32- + О2 2 SO42- + 2S
разлагается серобактериями до сульфидов, сульфатов и серы.
В связи с этим готовить раствор Na2S2O3 по точной навеске нельзя.
Приготовленный раствор приблизительно заданной концентрации хранят в склянке из темного стекла, защищенной от соприкосновения с кислородом, оксидом углерода (IV) воздуха. Раствор тиосульфата натрия стандартизируется через 7-10 дней по одному из исходных веществ KIO3, K2Cr2O7, I2 и др.
Точку эквивалентности устанавливают как с помощью специфического индикатора крахмала, так и безиндикаторным способом. В присутствии свободного йода I2 крахмал при комнатной температуре синеет. Появление синей окраски крахмала объясняется образованием адсорбционного комплекса I2 внутри спиралевидной цепи макромолекулы амилозы, входящей в состав крахмала. Чувствительность реакции очень высока. С повышением температуры чувствительность реакции уменьшается. Растворы крахмала разрушаются при хранении в течение нескольких дней под действием бактерий. Хлороформ и йодид ртути (II) подавляют размножение бактерий, поэтому в присутствии этих веществ раствор крахмала может храниться продолжительное время.
Безиндикаторный способ установления точки эквивалентности в йодометрии основан на том, что собственная желтая (до ятарно-коричневойособ установления точки эквивалентности в йодометрии основан на том, что собственная желтая ()тьчся продольм. дом воздуха.
) окраска йода в растворе достаточно интенсивна и при титровании бесцветных растворов позволяет обходиться без индикаторов.
Условия проведения йодометрических определений:
титрование ведут на холоду, так как йод – вещество летучее;
нельзя вести титрование в щелочной среде, так как образуется гипойодит и некоторые другие продукты реакции:
I2 + 2 ОН- IО- + I- + Н2О
IО- + 4 ОН- IО3- + 2 Н2О
при титровании окислителей необходимо брать избыток йодида калия, что способствует ускорению и более полному течению реакции в нужном направлении;
повышение кислотности также способствует ускорению реакции в нужном направлении, если Н+-ионы участвуют в окислительно-восстановительном процессе;
для полноты протекания процесса при йодометрическом определении окислителей реагирующую смесь выдерживают в темноте в течение 10-15 минут (после прибавления окислителя);
крахмал частично разлагается в присутствии большого избытка йода, поэтому индикатор крахмал никогда не прибавляют к раствору, содержащему йод в больших количествах, а добавляют в конце титрования. Изменение окраски титруемого раствора йода из янтарно-коричневой в соломенно-желтую указывает на то, что пора прибавлять индикатор. Высокая чувствительность йодометрии связана с тем, что крахмал окрашивается от ничтожно малых количеств свободного йода.

II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Определение йодного числа.
Определение кислотного числа.
Определение числа омыления.

Определение йодного числа
Основной теоретический материал
Ненасыщенность жира зависит от присутствия в его составе непредельных жирных кислот. Ненасыщенные соединения легко присоединяют по два атома галогена по месту каждой двойной связи. Обычно степень ненасыщенности определяют йодным числом. Йодное число измеряется количеством граммов йода, которое присоединяется к 100г жира.
Йодное число является одним из наиболее важных химических показателей для масел (жиров). Оно позволяет судить о степени ненасыщенности масла (жира), о склонности его к «высыханию», прогорканию и другим изменениям, происходящим при хранении и переработке пищевых и технических масел.
С двойными связями, кроме йода, реагируют также и другие галогены - хлор и бром. Однако они не только присоединяются по двойным связям, но и замещают атомы водорода в радикале. Йод же в определенных условиях реагирует преимущественно с двойными связями.
Механизм реакции взаимодействия ненасыщенных жирных кислот с йодом таков:

Ход работы
В сухую коническую колбу емкостью 250мл с пришлифованной стеклянной пробкой помещают 3-4 капли исследуемого масла. Навеску берут на аналитических весах следующим образом: взвешивают склянку (из-под пенициллина) с маслом и пипеткой в пробке, отмеривают из нее пипеткой в колбу 34 капли масла и снова взвешивают склянку. По разности масс определяют величину навески масла.
В колбу добавляют 20мл спирта для растворения навески. Если масло плохо растворяется, можно подогреть колбу на водяной бане.
Во второй колбе ставят «слепой опыт» (контроль), т.е. берут в нее 20мл спирта. В каждую колбу (опыт и контроль) прибавляют по 12,5 мл 0,2н спиртового раствора йода (из бюретки), смешивают, приливают по 100мл дистиллированной воды и хорошо встряхивают, закрыв пробкой.
Через 5мин содержимое колб оттитровывают 0,1н раствором тиосульфата сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1мл раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания.
Разность между количеством 0,1н раствора тиосульфата, затраченного на титрование опыта и контроля, является показателем количества йода, связанного навеской масла.
Йодное число (в г) вычисляют по формуле:

йодное число = 13 EMBED Equation.3 1415, где
V1 – количество 0,1н раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование контроля (в мл),
V2 – количество 0,1н раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование в опыте (в мл),
0,0127 – титр тиосульфата по йоду,
a – навеска жира (в г).
Масса навески жира определяется по формуле a = m .n, где m – масса одной капли жира, n – число капель.


Определение кислотного числа
Основной теоретический материал
Кислотное число характеризует кислотность жира, и измеряется оно числом миллиграммов гидроксида калия, необходимого для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1г жира.
Кислотное число наряду с другими физико-химическими показателями характеризует качество масла. Например, если масло получено из зрелых семян, то свободных жирных кислот в нем мало, в масле же из незрелых семян содержание свободных жирных кислот значительно. При хранении масла наблюдается гидролиз глицеридов, который приводит к накоплению свободных жирных кислот, т. е. к возрастанию кислотности. Повышенная кислотность масла указывает на снижение его качества.
Метод определения кислотного числа основан на том, что свободные жирные кислоты, имеющиеся в масле, оттитровывают 0,1н раствором КОН. Обычно титрование проводят гидроксидом калия, а не гидроксидом натрия, так как образующиеся калиевые мыла лучше растворимы в условиях опыта.


Ход работы
Исследуемое масло (массой 2-3г) помещают в коническую колбу емкостью 50-100 мл и растворяют в 10-15 мл нейтральной смеси спирта и эфира (1:1).
После растворения жира вносят 1-2 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,1н спиртовым раствором гидроксида калия до слабо розового окрашивания. Окраска после взбалтывания не должна исчезать в течение 0,51 мин.
Кислотное число вычисляют по формуле:
кислотное число = 13 EMBED Equation.3 1415, где
V- количество (в мл) 0,1н раствора КОН, израсходованное на титрование взятой навески жира,
T – титр 0,1н раствора КОН (в мг),
a – навеска жира (в мг).

Определение числа омыления
Основной теоретический материал
Числом омыления называется число мг гидроксида калия, необходимые для нейтрализации как свободных, так и связанных (в форме глицеридов) жирных кислот, содержащихся в 1г масла.
Содержание свободных жирных кислот в масле характеризуется кислотным числом (см. выше), а содержание связанных в виде эфиров кислот - эфирным числом, то есть числом миллиграммов гидроксида калия, необходимого для нейтрализации освобождающихся при омылении эфирных связей жирных кислот в 1г масла.
Экспериментально эфирное число определяется по разности между числом омыления и кислотным числом.

Ход работы
В одну колбу емкостью 50 мл вносят 0,5г жира, а в другую - 0,5мл воды.
В обе колбы добавляют из бюретки по 15 мл 0,5н спиртового раствора гидроксида калия.
Колбы закрывают пробками с обратными воздушными холодильниками (длина 70см) и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30-40 мин при периодическом встряхивании. Следят, чтобы жидкость в колбе слабо кипела и чтобы верхняя часть трубки не нагревалась.
По окончании омыления в каждую колбу добавляют по 15-20мл воды, по 3-4 капли фенолфталеина и титруют 0,5н раствором соляной кислоты до исчезновения розового окрашивания (определяют количество несвязавшейся щелочи).
Исходя из того, что 1 мл 0,5н раствора гидроксида калия соответствует 28 мг его, расчет числа омыления ведут по формуле:
число омыления = 13 EMBED Equation.3 1415, где
V1 – объем (в мл) 0,5н раствора HCl, затраченный на титрование контроля (колба с водой),
V2 - объем (в мл) 0,5н раствора HCl, затраченный на титрование опыта (колба с жиром),
a – масса жира (в г).

Вопросы для самопроверки
Окисляются ли жиры в естественных условиях?
Дайте определение характеристик жира: йодное число, кислотное число, число омыления, эфирное число. Взаимосвязаны ли понятия: кислотное число, эфирное число, число омыления, йодное число?
О каких свойствах жира можно судить по величине йодного числа?
Какие жиры (с большим или меньшим йодным числом) более ценны для технических целей и для питания?
Какие свойства жира характеризует кислотное число? В каких случаях наблюдается повышение кислотного числа?
Как изменяется кислотное число при хранении жиров?
Какова зависимость качества жира от кислотного числа?
Что характеризует число омыления?
Что такое омыление, какая реакция происходит при омылении?
Что характеризует эфирное число?
Принцип метода определения йодного числа.
Принцип метода определения кислотного числа.
Принцип метода определения числа омыления.
Что такое титр? Чему равен титр 1н КОН? Чему равен титр 0,5н КОН?
Что такое Траб.р-ра/опр.в-во? Чему равен титр 1н раствора тиосульфата натрия по йоду?
Какой способ и метод титрования применяется при определении йодного числа, кислотного числа, числа омыления?
Условия йодометрических определений.


Занятие 3-4. Семинар «Обмен липидов»
4 часа
Цель: изучить сущность, особенности и основные этапы метаболизма липидов, их особенности и значение данных процессов для организма; рассмотреть вопросы регуляции обмена данных процессов.

Основная литература:
Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А.Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.441-459.
2. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985. – Т2-С.551-568, С.621-650.
4. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.225-255.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.410-56.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания о сущности и особенностях процессов метаболизма липидов; ферментах, катализирующих данные процессы, об основных этапах и о биологическом значении катаболизма и анаболизма жиров. Необходимы умения по записи уравнений химических реакций, лежащих в основе процессов обменалипидов, расчета энергетическоговыхода при окислении жирных кислот и жиров.

План занятия
I. Теоретический практикум.
II.Решение задач.
I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ.
Вопросы для семинара
Превращения жиров в пищеварительном тракте.
Катаболизм и энергетика глицерола.

·-Окисление жирных кислот.
Энергетика процессов катаболизма жиров.
Синтез и ресинтез жиров.
Синтез нейтральных жиров.
Механизм ресинтеза жиров.
Биосинтез жирных кислот.
Метаболизм фосфолипидов.
Расщепление фосфолипидов.
Биосинтез фосфолипидов.
Регуляция липидного обмена.
Основные нарушения обмена жиров.
Изучение темы «Липиды» в школьных курсах биологии и химии.

Частные вопросы к теоретическому практикуму по теме
«Обмен липидов»

Назовите факторы, способствующие эмульгированию пищевых жиров в полости кишечника, а также вещества, стабилизирующие эмульсию. Для чего необходимо эмульгирование пищевых жиров в процессе пищеварения?
Перечислите ферменты, расщепляющие пищевые жиры, содержащиеся в пищеварительных соках. К какому классу они относятся? Какие связи гидролизуют? Какие при этом возникают продукты распада?
Назовите желчные кислоты. Что представляют собой парные желчные кислоты? Сколько может быть их разновидностей? Где и из чего в организме возникают желчные кислоты?
Какое количество пищевых жиров (в %) в процессе пищеварения гидролизуется полностью? Частично – до диглицеридов в моноглицеролов? Совсем не гидролизуется? Как всасываются продукты переваривания жиров?
Что происходит с продуктами переваривания пищевых липидов в клетках слизистой кишечника? Что представляют собой хиломикроны? Где они возникают? Какова их функция?
Как регулируется липолиз в клетках? Какие гормоны и как на него влияют?
Что представляют собой конечные продукты распада нейтральных жиров? Как они возникают? Какие конечные продукты возникают при распаде других липидов? Сколько энергии (в калориях) освобождается при окислительном распаде 1 г жира?
Обоснуйте более высокую энергетическую эффективность распада жиров по сравнению с распадом углеводов.
Назовите ферменты, участвующие в переваривании пищевых фосфолипидов. Какие связи они расщепляют? Какой фермент гидролизует пищевые эфиры холестерина? Какие продукты переваривания фосфолипидов в основном всасываются?
Какова судьба глицерола, образовавшегося при гидролизе пищевых жиров? Синтез скольких молекул АТФ обеспечивает энергией распад молекулы глицерина.
Почему процесс распада жирных кислот носит название «
·-окисление»? Где в клетках протекает этот процесс? В чем его биологическое значение?
Энергетический баланс
·-окисления жирных кислот и жиров.
Каковы особенности распада ненасыщенных жирных кислот?
Как происходит распад жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов?
Синтез, какого количества АТФ обеспечивает один цикл бета-окисления жирной кислоты. По какой формуле можно рассчитывать количество молекул АТФ, образующихся при полном распаде до конечных продуктов насыщенной жирной кислоты.
В какой части клеток и из какого вещества протекает биосинтез жирных кислот? Из каких источников и какими путями возникает ацетил-КоА? Перечислите источники НАДФН.
Рассмотрите строение и отдельные стадии участия мультиферментного комплекса синтетазы высших жирных кислот в синтезе жиров. Какая жирная кислота является основным продуктом действия синтетазы жирных кислот?
Как образуется малонил-коэнзим А и какова его роль в биосинтезе высших жирных кислот?
Охарактеризуйте особенности структуры и роль ацилпереносящего белка в функционировании синтетазы высших жирных кислот.
Как синтезируются жирные кислоты более длинные, чем пальмитиновая кислота? Как возникают ненасыщенные жирные кислоты? Какие специфические ферменты при этом участвуют?
Как синтезируются жирные кислоты с нечетным числом углеродных атомов?
Сравнительная характеристика синтеза и окисления ЖК (локализация процесса, переносчик ацильных групп, восстановители, окислители, направление синтеза и распада, организация ферметативной системы).
Посредством каких реакций осуществляется биосинтез триглицеридов?
Сколько молекул АТФ затрачивается на синтез одной молекулы нейтрального жира из глицерина и трех молекул жирных кислот? Ответ объясните.
Как используются организмом жиры жировых депо в качестве источников энергии? Какие ткани наиболее интенсивно их используют?
Каковы современные представления о путях синтеза триацилглицеролов? Отметьте роль фосфатидных кислот и коэнзимаА в синтезе триацилглицеролов.
Какова структура и роль фосфолипидов в строении мембран и клеточной проницаемости?
Как осуществляется распад и синтез фосфолипидов? Отметьте активное участие в этих процессах нуклеклеозидтрифосфатов.
Сколько молекул макроэргов (АТФ, ЦТФ) затрачивается на синтез одной молекулы лецитина из глицерина, двух молекул жирных кислот и холина? Ответ поясните.
Из чего и где в организме образуется кетоновые тела? Происходит ли это в здоровом организме. Если да, то каково биологическое значение их образования?
Как регулируется липогенез в клетках? Какие гормоны на него влияют? Где в организме особенно интенсивно протекают процессы синтеза триацилглицеринов?
Как регулируется гидролиз жиров в клетках и окисление жирных кислот?
Как регулируются биосинтез жирных кислот и биосинтез жиров?
Как изменяется липидный обмен при ожирении? Какие различают типы ожирения, каковы их причины? Почему больным, страдающим ожирением, рекомендуется ограничение потребления углеводов и воды?
Каковы причины возникновения атеросклероза? Каковы последствия этого заболевания для организма?

II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
1. Синтез какого количества АТФ обеспечивает один цикл
·-окисления жирной кислоты. По какой формуле можно рассчитывать количество молекул АТФ, образующихся при полном распаде до конечных продуктов насыщенной жирной кислоты. Сделайте расчет для лауриновой кислоты.
2. Сколько молекул макроэргов (АТФ) затрачивается на синтез одной молекулы нейтрального жира из глицерина и трех молекул жирных кислот? Ответ объясните.
3. Сколько молекул макроэргов (АТФ, ЦТФ) затрачивается на синтез одной молекулы лецитина из глицерина, двух молекул жирных кислот и холина. Ответ поясните.
4. Напишите уравнения реакций, протекающих по следующей схеме:



5. Путь углерода в синтезе жирных кислот. Опираясь на ваши знания о биосинтезе жирных кислот, объясните следующие экспериментальные данные:
а) Добавление равномерно меченного 14С-ацетил-КоА к растворимой фракции печени приводит к образованию равномерно меченого 14С-пальмитата.
б) Вместе с тем добавление к растворимой фракции печени следовых количеств равномерно меченого 14С-ацетил-КоА в присутствии избытка малонил-КоА приводит к образованию пальмитата, содержащего 14С только в положении 15 и 16.
6. Роль оксида углерода (IV) в синтезе жирных кислот. Оксид углерода (IV)– обязательный участник биосинтеза жирных кислот. В чем заключается специфическая роль СО2? Будет ли пальмитат, образовавшийся при инкубации растворимой фракции печени с 14СО2 и другими компонентами, необходимыми для биосинтеза жирных кислот, содержать 14С? Обоснуйте ваш ответ.
7.Сколько граммов жира, представляющего собой чистый триолеилглицерол, было взято, если для гидрирования двойной связи в образовавшейся в результате его гидролиза кислоте потребовалось 13,44 л водорода (при н.у.)?
8. Один моль триолеилглицерола (Mr =884) поглощает три моль иода (Mr =254). Чему равно иодное число?
9. Чему равен объем образующегося СО2 (н.у.) при окислении одного моль пальмитата (Mr =256)?
10. При омылении 0,5 моль тристеарилглицерола в избытке щелочи образовалось 40 г глицерина. Сколько жира (%) не подверглось гидролизу?

Задания для контроля и самоконтроля знаний
Напишите уравнения реакций ступенчатого ферментативного гидролиза триацилглицеролов: трипальмитата, тристеарата. Назвать ферменты.
Напишите уравнение превращения глицерола в ПВК. Какие при этом требуется ферменты помимо ферментов гликолитического пути?
Напишите уравнение активирования пальмитиновой кислоты. Какой фермент катализирует этот процесс? К какому классу он относится?
Напишите
· – окисление (один цикл) активированной пальмитиновой кислоты. Назовите действующие ферменты, укажите, к каким классам они относятся. Опишите дальнейшую судьбу возникающих веществ.
Напишите уравнение
·–восстановления в
·-кетопальмитил–АПБ. Назовите участвующие ферменты и классы, к которым они относятся. Назовите также образующийся продукт.
Напишите (полусхематично) уравнение образования глицерина из углеводов и белков (аминокислот).
Напишите уравнения синзеза фосфатидхолина из фосфатидной кислоты, содержащей миристиновую и олеиновую кислоты и активного холина. Какого класса ферменты катализируют эту реакцию? Как они называются?
Напишите уравнения образования активного холина (ЦДФ-холина). Назовите участвующие ферменты, а также классы, к которым они относятся. Формулу ЦДФ-холина напишите без буквенных сокращений.
Напишите уравнения синтеза фосфатидилхолина из фосфатидной кислоты (содержащей миристиновую и олеиновую кислоты) и активного холина. Какого класса фермент катализирует эту реакцию? Как он называется?
Написать сбалансированные суммарные уравнения для образования CH3CO~SKoA:
а) из стеариновой кислоты;
б) из Я-оксимасляной кислоты.
Напишите сбалансированное уравнение синтеза:
а) триацилглицерола из глицерола и жирных кислот;
б) фосфатидилсерина de novo из серина, глицерола, жирных кислот.



ТЕМА 10. МЕТАБОЛИЗМ

Занятие 1-2. Семинар «Метаболизм. Интеграция метаболизма»
4 часа
Цель: изучить сущность и основные этапы метаболизма, его особенности и значение для организма, рассмотреть уровни регуляции метаболизма.

Основная литература:
1.Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.
Дополнительная литература:
1.Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986. – С.502-514.
2. Ленинджер А. Л. Основы биохимии в 3-х томах. – М.: Мир, 1985.- Т2- С.375-400.
3. Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах. Мари Р., Греннер Д. и др. – М.: Мир, 1993. - Т1 – С.; Т2 – С.299-355.
4. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.- С.109-118.

Методические рекомендации к занятию
При подготовке к семинару необходимо обобщить знания о сущности и особенностях метаболизма, его основных этапах и биологическом значении; его регуляции.
План занятия
Теоретический практикум.
Решение задач.

I.ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ
Вопросы для семинара
Катаболизм, анаболизм, метаболизм. Три стадии катаболизма и анаболизма.
Общие промежуточные продукты метаболизма (амфиболические пути).
Энергетический цикл в клетках.
АТФ - универсальная энергетическая «валюта» в обменных процессах.
Пути и механизм использования энергии.
Обмен веществ как единая система процессов:
а) взаимосвязь обмена нуклеиновых кислот и белков;
б) взаимосвязь обмена нуклеиновых кислот и углеводов;
в) взаимосвязь обмена нуклеиновых кислот и лппидов;
г) взаимосвязь обмена углеводов и белков;
д) взаимосвязь обмена белков и липидов;
е) взаимосвязь обмена углеводов и липидов.
Регуляция метаболических процессов.
Роль витаминов в обмене веществ.
Роль минеральных веществ в обмене веществ
Гормоны, их природа, физиологическая и биохимическая роль.
Биологически активные вещества (антивитамины, ауксины, антибиотики и др.)
Вопросы обмена веществ, энергии, регуляции обмена веществ в курсе биологии средней школы.
II. РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ
Задача 1. Сохранение сладкого вкуса кукурузы.
Сладкий вкус зерен в свежесобранных початках кукурузы обусловлен высоким содержанием в них сахара. Кукуруза, которую продают через несколько дней после сбора, имеет более низкую сахаристостъ, так как около 50 проц. свободного сахара в зернах превращается в крахмал в течение одного дня хранения, чтобы сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки помещают на несколько минут в кипящую воду («бланшируют»), а затем охлаждают в холодной воде. Кукуруза, обработанная таким образом и хранящаяся в замороженном виде, сохраняет свои сладкий вкус. В чем биологическая основа этой обработки?
Задача 2. Защита фермента от тепловой денатурации.
При нагревании раствора фермента со временем он постепенно утрачивает каталитическую активность, ело обусловлено разворачиванием молекулы нативного фермента, которая по мере возрастания ее тепловой энергии принимает конформацию беспорядочного клуба. При инкубации раствора гексокиназы в течение 12 мин. при 45оС фермент теряет 50 проц. активности, но если гексокиназа инкубируется при 45оС в присутствии очень большой концентрации одного из ее субстратов глюкозы, то она утрачивает только 3 проц. активности. Объясните, почему тепловая денатурация гексокиназы замедляется в присутствии одного из ее субстратов.
Задача 3. Помощь при отравлении метанолом.
Метанол (древесный спирт), который когда-то использовался как антифриз для автомобилей, очень токсичен; прием внутрь всего лишь 30 мл метанола может привести к смерти. Такая необычно высокая токтичносгь метанола обусловлена действием не только самого метанола, сколько продукта его метаболизма формальдегида. Метанол быстро окисляется до формальдегида под действием фермента печени алкогольдегидрогеназы. Один из методов лечения при отравлении метанолом состоит в том, что больному назначают этанол (этиловый спирт), внутривенно в количествах, которые у здорового человека вызывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение оказывается эффективным?
Задача 4. Полиневрит у голубей.
В ставших классическими экспериментах голуби, содержавшиеся на экспериментальной диете, утрачивали координацию движений и способность удерживать свое тело в равновесии. Уровень пирувата в крови и мозгу этих птиц значительно превышал нормальный. Такое состояние проходило, если голубям давали мясо. Объясните эти наблюдения.
Задача 5. Сравнение катаболизма и анаболизма глюкозы.
На таблице «Гликолиз» изображено взаимопревращение глюкозы и фруктозо-1,6-дифосфата. В обмене углеводов эта последовательность реакций играет ключевую роль. Расщепление глюкозы представляет собой катаболический путь, а ее биосинтез из фруктозо-1,6-дифосфата анаболический. Одни и те же гексозомонофосфаты служат промежуточными продуктами того и другого пути. Однако, хотя пути эти очень схожи, между ними есть явные различия. Выявите их:
а) напишите суммарное уравнение катаболического пути расщепления глюкозы до фруктозо-1,6-дифосфата;
б) то же самое для анаболического пути;
в) укажите различие между кататолическими и анаболическим путями, проявляющееся в их суммарных уравнениях. Можно ли считать, что каждый из этих путей является простым обращением другого?
г) чем обеспечивается направленность катаболизма глюкозы? Что препятствует обращению этого процесса?
д) возможно ли, чтобы один и тот же фермент катализировал и катаболическую и анаболическую реакции взаимопревращения глюкозы и глюкозо-6-фосфата. Возможно ли это для взаимопревращения глюкозо6фосфата и фруктозо-6-фосфата?
Задача 6. Значение витамина В1.
Для больных с тиаминовой недостаточностью характерен целый ряд неврологических симптомов: утрата рефлексов, беспокойство, спутанность сознания. Объяснить почему недостаточность тиамина отражается на функции мозга.
Задача 7. Защита растений - суккулентов.
Произрастающие в засушливых районах суккуленты обычно покрыты восковым налетом. Как это способствует выживанию растений?
Задача 8. АТФ, образованный из глюкозы или жирной кислоты.
Рассчитайте, сколько молей АТФ синтезируется при окислительном фосфорилированин из 1г глюкозы, 1г пальмитиновой кислоты и 1г трипальмитина.
Задача 9. Потеря веса при голодании.
Когда человек использует «ударную» строгую диету, сначала он теряет вес в основном за счет обезвоживания организма. Почему? При продолжительном голодании потеря веса за день меньше, чем в начальных периодах. Как вы это объясните?
Задача 10. Связь между питанием и ожирением.
Потребление в течение продолжительного периода продуктов, калорийность которых превышает рекомендуемые дозы, может привести к ожирению. Диета какого типа, богатая сахарами или жирами, способствует ожирению? Поясните ваш ответ?
Задача 11. Баланс калорий.
Молодая женщина, обнаружила, что она слишком поправилась за последний год. Ее диета содержала 2400 ккал/сут. Таблицы стандартных корреляций роста, телосложения, возраста и веса показывали, что излишек ее веса составляет 20 проц. Для постоянного поддерживания веса на нормальном уровне она должна в день получать в среднем 2100 ккал. Используя данные, предложите 6 разных видов пищи, которые следует потреблять этой женщине в ограниченном количестве, чтобы поддерживать нормальным вес.
Задача 12. Питание и болезнь почек.
Люди с почечной недостаточностью теряют способность выводить из организма шлаковые продукты с достаточной скоростью. Они должны регулярно подвергаться диализу, в процессе которого кровь диализируется через мембрану, чтобы вымыть такие продукты, как мочевина и мочевая кислота. Кроме того, их рацион должен содержать ограниченнее количество определенных белков. Объясните, почему? Какой источник белка предпочтительнее для их питания яйца или кукуруза? Почему?
Задача 13. Необходимость в особой пище.
Распространено мнение, что молоко это превосходная пища, и для правильного питания оно должно быль включено в рацион каждого человека. Верно ли это? Предложите биохимическое обоснование своего ответа.
Задача 14. Пища для альпинистов.
Предложим, что нужно составить список продуктов для альпиниста, собирающегося в 48-часовое восхождение на одну из вершин Гималаев: а) Какие особые виды продуктов вы бы включили? б) Какие продукты вы бы сочли ненужными? в) Какие витамины и минеральные вещества вы бы предложили в дополнение к рациону? Дайте объяснение своим ответам.
Задача 15. Мясо как источник калорий.
В нескольких районах земного шара с легко доступными источниками природных ресурсов принято во время каждой еды, потреблять большие количества мяса. Если любители мяса едят его в количестве, превышающем их потребности (в калориях), то могут приобрести «лишний» вес:
а) Каким метаболическим путем мясо, богатое белком, может привести к отложению триацилглицеролов?
б) Какие другие метаболические изменения могут произойти в результате такого питания?
Задача 16. Суточная утилизация АТФ в организме взрослого человека.
а) Количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата (Ф) при концентрации исходных веществ и продуктов 1М (стандартное состояние), составляет 7,3 ккал/моль. Поскольку истинные физиологические концентрации АДФ, Ф и АТФ в клетках отличаются от 1М, количество свободной энергии, необходимой для синтеза АТФ при физиологических условиях, отличается от
·Yо. Вычислите количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТР в клетке печени человека при физиологических концентрациях АТР, АДР, Р равных соответственно 3,5, 1.50, 5,0 мМ.
б) Здоровый взрослый человек, вес которого составляет около 70кг, должен ежедневно получать с пищей 2000 ккал. Пищевые вещества расщепляются в процессе метаболизма и высвобождающаяся при этом свободная энергия используется для синтеза АТР, который затем расходуется на выполнение ежедневной работы организма, химической и механической. Вычислите (в весовых единицах) количество АТР, утилизируемого за сутки организмом взрослого человека, если принять, что эффективность превращения заключенной в пище энергии в энергию АТР равна 50%. Какой процент от веса тела составляет это количество АТР?
в) Хотя ежедневно в организме взрослого человека образуется значительные количества АТР, вес тела, его строение, состав за этот период существенно не меняется. Как можно объяснить это?
Задача 17. Непереносимость молока у выходцев с Востока и у негров.
У взрослых негров и выходцев с Востока в результате употребления в пищу молока часто наблюдаются вздутие живота, спазмы, боли и понос. Эти симптомы возникают через 1-4 часа после потребления всего лишь одного стакана молока (натурального или порошкового). Каким компонентом молока обусловлены эти симптомы? Каким образом этот компонент вызывает появление указанных симптом?

Задача 18. Аланин и глутамин в крови.
В плазме крови содержатся все аминокислоты, необходимые для синтезов белков в организме, но в разных количествах. При этом концентрации двух аминокислот, а именно аланина и глутамина намного выше, чем остальных. Объясните возможные причины высокого содержания этих двух аминокислот.
Задача 19. Метаболизм глутамата в мозгу.
Глутамат, доставляемый кровью в ткань мозга, превращается там в глутамин, который можно обнаружить в оттекающей от мозга крови. Каков смысл этого метаболического превращения? Как оно происходит? В действительности в мозгу вырабатывается больше глутамина, чем может образоваться из доставляемого кровью глутамата. Откуда берется это дополнительное количество глутамина?
Задача 20. Отсутствие глицеролкиназы в жировой ткани.
Глицерол-3-фосфат - ключевой промежуточный продукт в биосинтезе триацилглицеролов. Клетки жировой ткани, специализирующиеся на синтезе и распада триацилглицеролов, не способны непосредственно использовать глицерол поскольку в них нет глицеролкиназы, катализирующей реакцию:
Глицерол + АТР Глицерол-3-фосфат + АДР
Как обеспечивается жировая ткань глицерол-3-фосфатом, необходимым для синтеза триацилглицеролов? Объясните.
Задача 21. Перевариваемость казеина и кератина.
Казеин (мол. масса 23600) крупного рогатого скота - один из белков коровьего молока не содержит остатков цистеина и цистина. Кроме того, четвертичная структура этого белка слабо выражена: его нативная конформация напоминает беспорядочный клубок. В отличие от этого
·-кератин (белки, содержащиеся в волосах, шерсти, ногтях и т. д.) очень богаты остатками цистеина и цистина. К тому же эти белки обладают высокоупорядоченной вторичной и третичной структурами. Объясните, каким образом свойства этих двух групп белков отражаются на их переваримости. Почему, в частности, молоко, выпиваемое котенком, служит для него прекрасным источником аминокислот, тогда как его собственный мех не переваривается («волосяные пробки» тяже закупорить кишечник).
Задача 22. Токсическое действие морской воды.
Почки человека великолепное устройство, регулирующее удаление ионов натрия из крови путем образования мочи, в которой содержание ионов натрия достигает 340мМ. Однако в морской воде концентрация ионов натрия вдвое выше той, которую способны создать почки здорового еловека. Если человек пьет только морскую воду, то происходит накопление хлорида натрия во внеклеточной жидкости (т. е. жидкости, окружающей клетки тела), по не во внутриклеточной жидкости. Длительное потребление морской воды приводит к смерти вследствие повреждения клеток мозга. Почему потребление морской воды на протяжении длительного времени вызывает повреждение клеток?
Задача 23. Глицерол, образующийся при расщеплении жиров, превращается в результате двух ферментативных реакций в промежуточный продукт гликолиза ФДА. Напишите уравнения этих реакций. Назовите ферменты, напишите суммарное уравнение превращения глицерола в ПВК. Сколько молей АТФ образуется при превращении 1моль глицерина в анаэробных и аэробных условиях?
Задача 24. Объясните, почему у растений, произрастающих на заболоченных, плохо дренированных почвах обнаруживаются симптомы резкой недостаточности тех или иных минеральных веществ?
Задача 25. Объясните, почему крупные морские животные, такие, как тюлени и моржи, а также рептилии, ведущие земноводный образ жизни, например, черепахи, крокодилы, могут оставаться под водой?
Задача 26. Возможен ли реальный синтез глюкозы из ПВК в условиях, когда ЦТК и окислительное фосфорилирование полностью ингибированы?
Задача 27. Как влияет повышение контцентрации АТФ и АМФ на каталитическую активность фруктозодифосфатазы и фосфофруктокиназы? Как сказываются эти эффекты на относительной величине потока метаболитов в глюкогенезе и гликолизе?
Задача 28. Малатдегидрогеназа, содержащаяся в клетках обкладки С4растений, катализирует реакцию, для которой можно указать аналогичную реакцию в цикле лимонной кислоты. Назовите эту аналогичную реакцию. Объясните, в чем заключается аналогия.
Задача 29. Проводилось паталогоанатомическое исследование кусочка ткани печени. У больного подозревали дефект одного из ферментов углеводного обмена. Было показано, что гомогенат ткани: 1) расщеплял гликоген до глюкозо-6-фосфата, 2) не обладал способностью синтезировать гликоген из какого бы то ни было сахара, 3) синтезировал глюкозо-6-фосфат из лактата. Ниже названы три фермата, какой из них был дефектен в этом случае: а) гликогенфосфорилаза, б) фруктозодифосфатаза, в) УДФ- глюкозофосфорилаза? Аргументируйте свой выбор.
Задача 30. На рисунке показана концентрация лактата в крови до бега на 400м, во время бега и после него.


а) чем вызывается быстрое повышение концентрации лактата?
б) что является причиной снижения уровня лактата после бега? Почему снижение происходит медленнее, чем подъем?
в) почему в состоянии покоя концентрации лактата в крови не равна 0?
Задача 31. Когда человек переходит на рацион с высоким содержанием белка, у него возрастает потребность в витамине В6. Дайте объяснение этому явлению.
Задача 32. Если во время еды любители мяса едят его в количестве, превышающем их потребности (в калориях), они могут приобрести «лишний» вес. Каким метаболическим путем мясо, богатое белком, может привести к отложению триацилглицеролов?
Рекомендуемая литература

Основная литература:
1.Филлипович С.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. Биологическая химия: учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. – 254 с.
2. Проскурина И.К. Биохимия: Учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС-Пресс, 2003. – 235с.
3. Филлипович С.Ю., Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учебное пособие для вузов. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 404с.

Дополнительная литература:
Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – М.: Москва, «Медицина», 2007.
Браунштейн Л.Е. На стыке химии и биологии. – М.: Наука, 1987.
Грин Н. Биология в 3-х т. / Н. Грин, Стаут У., Тейлер Д. – М.: Мир, 1990.
Досон Р. Справочник биохимика. – М.: Мир, 1991.
Кноррре Д.Г. Биохимия: Учебник для хим., биолог., медиц. спец. вузов / Д.Г.Кнорре, Мызина С.Д. – М.: Высш. школа, 1998 – 478с.
Кольман Я., Рем К.-Г.Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2004. - 469 с.
Ленинджер А. Основы биохимии в 3-х томах. – М., 1985.
Марри Р. Биохимия человека в 2-х томах – М.: Мир, 1993.
Мусил Я. Современная биохимия в схемах / Я.Мусил, О. Новакова, К. Кунц – М.: Мир, 1981.
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. универ. /А.А. Анисимов, А.Н.Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. – М.: Высшая школа, 1986.
Рис Э. От клеток к атомам / Э. Рис, М. Стенберг – М.: Мир, 1988.
Сидорская Э.А., Афиногенова С.Г. Витамины. – Арзамас: АГПИ, 1990.
Страйер Л. Биохимия, в 3-х томах – М.: Мир, 1985.
Тюкавина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. – М.: Медицина, 1991.
Филлипович Ю.Б. Упражнения и задачи по биологической химии / Ю.Б. Филлипович, Г.А. Севастьянова, Л.И. Щеголева – М., 1986.
19. Филлипович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Лань Агар, Флинт, 1999.
20.Филлипович Ю.Б. Упражнения и задачи по биологической химии / Ю.Б. Филлипович, Г.А. Севастьянова, Л.И.Щеголева – М., 1986.















Учебное издание
Опарина Светлана Александровна

Биологическая химия
и
основы биорегуляции организмов

Учебно-методическое пособие

В авторской редакции
Технический редактор С.П. Никонов






Издатель:
Арзамасский государственный педагогический институт
им. А.П. Гайдара
607220, г. Арзамас, Нижегородская обл., ул. К.Маркса, 36

Участок оперативной печати АГПИ
607220, г. Арзамас, Нижегородская обл., ул. К.Маркса, 36













13PAGE 15


13 PAGE \* MERGEFORMAT 1412515




    " & ( 4 : > @ J P Ђ € Љ Њ Ћ ђ ’ ” љ Ъ в д ж и к м о р т ф ц ш ъ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·»° Ё
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·°
·@
·Ђ
·
·°
·@
·Ђ
·
·
·
·
·@
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·б
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ѓ
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·А
·
·
·
·
·Л
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·A
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·°
·
·1
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·q
·
·
·@
·Ђ
·Ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·Я
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·‡
·џ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·№
·њ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·C
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·J
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·©
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·…
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ђ
·
·
·
·
·A
·Ђ
·
·ў
·
·
·Ы
·
·
·
·
·
·
·A
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·K
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·@
·
·
·
·
·
·F
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·љ
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·б
·
·
·B
·
·
·
·
·
·
·@
·
·Н
·
·
·B
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·»
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·л
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·q
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·њ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ѓ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·б
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ћ
·
·
·
·
·
·
·
·
·ѓ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·‚
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·p
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ь
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·З
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·„
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·C
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·†
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·µ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·еb
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·у
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ў
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·»
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ж
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·"
·
·
·
·
·
·
·«
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·b
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·a
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·9
·
·
·
·
·
·
·
·є
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ј
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·О
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·…
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ґ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ґ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·в
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Р
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·џ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·'
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·‘
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Є
·
·
·
·
·
·
·
·ЙB
·
·№
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·x
·
·
·
·
·
·
·„
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·B
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·@
·
·
·
·
·
·
·
·B
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·a
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·
·‘
·
·
·
·м
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·—
·
·
·
·
·ќ
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·V
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·O
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·w
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·¦
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ј
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·І
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·г
·
·
·
·
·
·
·
·Т
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Щ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·>
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°Ю
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·A
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·›
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·л
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ј
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·x
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Є
·
·
·
·
·з
·
·
·
·
·›
·
·
·
·
·
·
·Ч
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·A
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·H
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·[
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·И
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·м
·
·
·
·
·
·
·Ш
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·ґ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·>
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·&
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·B
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Н
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·}
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·…
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·К
·
·
·Е
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·O
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·b
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·†
·
·
·R
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ж
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ы
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·‚
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·
·
·
·…
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·!
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·@
·Ђ
·Ѓ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·°
·
·)
·
·
·
·
·
·l
·
·
·
·~
·
·
·
·
·О
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·з
·
·
·°
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·1
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·¦
·
·•
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ђ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Ё
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·Є
·
·
·
·
·С
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·‡
·B
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·“
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·ҐRoot Entry

Приложенные файлы

  • doc 18713718
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий