Lektsia 13 ppt


Чтобы посмотреть презентацию с картинками, оформлением и слайдами, скачайте ее файл и откройте в PowerPoint на своем компьютере.
Текстовое содержимое слайдов презентации:

Принципы генной терапии наследственных заболеваний Более чем 5000 пациентов были подвергнуты генотерапии в течение последних 12 лет Классификация генной терапииПо цели воздействия: позитивная ( компенсация экспресcии гена) негативная (подавление функций гена) Классификация генной терапииПо способу введения гена: ex vivoin situin vivoin utero Классификация генной терапииПо типу векторной системы: вирусные векторы невирусные векторы по типу клеток-мишеней соматическая фетальная по цели воздействия позитивная негативная по тактике введения агента ex vivo (клетки крови) in situ (локально) in vivo (системно) по типу переноса генов векторный переносы безвекторный перенос по типу агента ДНК РНК Классификация генной терапии Генотерапевтические агенты Кодирующие геныsiРНКРибозимыРНК-ловушки Кодирующие гены Например, используются в генотерапии для лечения моногенных заболеваний для заместительной терапии. siРНК Используется для подавления экспрессии генов Wasi Длинноцепочечная dsРНК Разрушение dsРНК Развoрачивание РНК Связывание RISC мРНК Разрушение мРНК siРНК мРНК Рибозимы РНК - ловушки Гиперэкспрессия коротких РНК (РНК – ловушки), направленных на cis – активаторные регуляторные элементы, могут использоваться как ловушки для trans – активаторных белков.Механизм действия - блокирование связывания трансактиваторных белков вируса с регуляторными элементами. РНК - ловушки Гиперэкспрессия коротких РНК (РНК – ловушки), направленных на cis – активаторные регуляторные элементы, могут использоваться как ловушки для trans – активаторных белков.Механизм действия - блокирование связывания трансактиваторных белков вируса с регуляторными элементами. Вирусные РНК транскрипты TAR-ловушки Белки – генотерапевтические агенты Трансдоминантные негативные белки – мутантная версия регуляторных или структурных белков Нарпимер, трансдоминантные негативные белки Tat и Rev-белков блокируют репликацию, созревание мРНК и выходу их из ядра в ВИЧ инфицированных клетках. Суицидные гены Вместо ингибирования (или компенсации) функции дефектного гена возможно использование суицидных генов, экспрессия которых вызывает гибель клетки-мишени. Примеры: А-цепь дифтерийного токсина ген цитозиндеаминазы ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV tk) Создание конструкций, несущих гены:тимидин-киназы,цитозин-дезаминазы.Разработки касаются:лечения глиомы головного мозга,рака молочной железы, рака простаты. Создание фибробластов, продуцирующих рекомбинантные ретровирусы, несущие tk-ген, т.е. VPC-tk клеток Трансплантация VPC-tk клеток в клетки мозга Индукция гибели раковых клеток Суицидные гены Bystander effect(«эффект свидетеля»Распространение токсичных продуктов фосфорилирования GCV через межклеточные щелевые контакты.Индукция специфического иммунитета.Фагоцитоз апоптических везикул, содержащих метаболиты GCV. Иммунотерапия ДНК – вакцины ДНК - вакцины Плазмидный вектор для экспрессии HBs антигена против гепатита ВСпособы введения:ВнутрикожноПодкожноВнутримышечно? Внутривенно ДНК - вакцины Преимущества: дешевизна производства отсутствие иммуногенности ( Анти-ДНК антитела) экспрессия продукта гена в нативной форме индукция Т-клеточного иммунитетаНедостатки: низкая эффективность доставки низкая емкость векторов высокая вероятность интеграции в геном клетки Генная терапия в медицине История: 14 сентября 1990 F. Anderson и R.M. Blaese представили первый ГТ протокол успешного лечения АDА –синдрома:Девочка Ashanti (4 года)ЕЕ лимфоциты были подвержены генетической модификации (~109) ex vivo  и введены в организм с помощью ретровирусного вектора, несущего ADA-ген (вводили 1 млрд. вирусных частиц). Cynthia (9 лет) подверглась лечению в этом же году. Проблема: инъекции производились многократно. Сентябрь 17, 1999Лечение орнитин-транскарбамоилазной недостаточности Нарушение метаболизма мочевины (1 : 10 000)Ген сцеплен с Х-хромосомойЖенщины носители, мужчины болеютЦикл мочевины - 5 ферментов печени которые выводят из организма аммоний (токсический продукт) Если ферменты дефектны, аммоний аккумулируется в крови и попадает в мозг, что вызывает кому, повреждение мозга и смерть. Пациент погиб через 3 дня по причине респираторной недостаточности. ЦистофиброзДля введения гена использовали аденовирусный вектор. Генной терапии подверглось 10 человек, которые были разделены на 3 группы: 2 группы получали вирус с аэрозолем через нос и непосредственно в легкие.1 группа - только через нос. Только непродолжительная экспрессия наблюдалась, так как аденовирус не интегрируется в геном. ВИЧТ-лимфоциты ВИЧ-пациентов обрабатывались ex vivo Rev и Env дефектными мутантными штаммами ВИЧ-вируса. Была получена высокая концентрация клеток, которые вносились в организм пациента. Стимулировался хороший CD8+ цитотоксический Т-клеточный ответ (Tcyt) Фамильная гиперхолестеринемияДефект рецепторовлипопротеинов низкой плоности на клетках печени.Уровень холестерина в организме повышается, что увеличивает риск кардио-васкулярной недостаточности. 1993  Первая попытка.Ретрвирусный вектор был введен в 3.2 x 109 клеток печени (~15% от общего числа в печени) ex vivoЗатем клетки реинфузировали в организм пациентаБыли получены обнадеживающие результаты. Затем была предпринята попытка генотерапии заболевания Леш-Нихана (дефект гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы), Гаучер-болезни (дефект глюкоцереброзидазы) и других моногенных заболеваний. Низкая частота трансдукции.Нестабильная экспрессия трансгенов в организме человека. В 1993 г. – генготерапия муковисцидоза и в 1995 г. - первые попытки лечения глиобластомы. Эти исследования по генной терапии и попытки клинических испытаний до 1996 г. все еще оставались единичными. В 1997 году начался новый этап. В это время наметился качественный прорыв в технике доставки чужеродных генов и, как казалось многим, появились реальные шансы быстрого терапевтического эффекта при самых разных заболеваниях. Число проектов, одобренных в США Комитетом RAC (Recombinant Advisory Committee) увеличилось до 200 и продолжает стремительно возрастать, достигнув к концу 1999 г. уже 400. Началась разработка подходов генотерапии рака: Экспрессия антигена B7 в клетках опухоли может обеспечить активацию иммунной системы больного в отношении опухоли. Трансфекция опухолевых клеток цитокиновыми генами  GM-CSF стимулирует перемещение дендритных клеток в область опухоли , которые зарегистрируют опухолевый антиген и презентируют его Т клеткам. Восстановлениеs клеточного цикла, нарушение которого произошло в результате мутации в гене p53 путем замены его на «здоровый» ген. Восстановлениеs клеточного цикла, нарушение которого произошло в результате мутации в онкогене путем замены его на «здоровый» ген. D 1993 г. - муковисцидоза и в 1995 г. - первые попытки лечения глиобластомы. Эти исследования по генной терапии и попытки клинических испытаний до 1996 г. все еще оставались единичными. В 1997 году начался III этап. В это время наметился качественный прорыв в технике доставки чужеродных генов и, как казалось многим, появились реальные шансы быстрого терапевтического эффекта при самых разных заболеваниях. Число проектов, одобренных в США Комитетом RAC (Recombinant Advisory Committee) увеличилось до 200 и продолжает стремительно возрастать, достигнув к концу 1999г. уже 400. Разработана методика клинических испытаний генотерапевтических препаратов I фаза. Оценка токсичности генной конструкции. II фаза. Ограниченные испытания на небольшом контингенте больных. III фаза. Широкомасштабные мультицентровые клинические испытания. Зарегистрировано 636 клинических протоколов генной терапии. 3496 пациента имеют в своем организме генетически модифицированные клетки. Клинические испытания генотерапевтических препаратов 63,4 % протоколов и 68,4 % пациентов - генная терапия злокачественных новообразований (цитокины и суицидные гены). 12,3 % и 8,8% - генная терапия моногенных наследственных болезней. 6,4% и 11,7% - генная терапия инфекционных заболеваний. Клинические испытания генотерапевтических препаратов После резекции в ложе опухоли вносятся мышиные клетки РА317, продуцирующие ретровирусный вектор, экспрессирующий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса. Через неделю больным вводится препарат ганцикловир, который после фосфорилирования in situ обрывает синтез ДНК в быстроделящихся клетках. Генная терапия глиобластомы головного мозга III фаза клинических испытаний Реализуемые механизмы: прямой эффект фосфорилированного ганцикловира «bystander effect» - гибель соседних опухолевых клеток за счет проникновения токсического продукта (трифосфат ганцикловира) локальное воспаление как результат введения мышиных клеток системный иммунный ответ Генная терапия глиобластомы головного мозга III фаза клинических испытаний Генная терапия остеосаркомы (ESCCHN)(2 протокола) Частота встречаемости - 40 000 случаев в год (США)Предпосылки - более 50% пациентов, имеют повышенный уровень экспрессии мутантной формы р53.Генотерапевтический агент - фактор супрессии опухоли (кДНК р53).Вектор – аденовирус тип 5. Способ введения - прямая инъекция в опухоль.Увеличение выживаемости в 2 раза. III фаза клинических испытаний Генная терапия метастатической меланомы(иммунотерапия) Генотерапевтический агент - HLA-B7/Beta-2 Microglobulin cDNA.Презентация антигенов MHC класса I на поверхности опухолевой клетки после экспрессии HLA-B7/Beta-2 Microglobulin cDNA.Вектор - плазмидная ДНК в комплексе с катионными липосомами и DMRIE-DOPE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide/dioleyl-phosphatidyl-ethanolamine).Способ введения – прямая инъекция в опухоль.31% пациентов не имели возврата опухоли в течение 6 лет. Первый трагический случай Смерть в сентябре 1999 г. Джесси Гелзингера (США).Страдал недостаточностью орнитинкарбамоил-трансферазы (ОКТ). Смерть наступила после третьей инъекции аденовирусного вектора последнего поколения, экспрессирующего ген ОКТ.Вскрытие показало атрофию внутренних органов по механизму апоптоза.Новое явление взаимодействия вирусного и человеческого генома? ● муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) - перенос гена МТР (муковисцидозный трансмембранный регулятор) с помощью аденовирусного вектора и липосом. мышечная дистрофия Дюшена - введение нормальных копий кДНК гена дистрофина с помощью ретровирусных векторов. рестеноз (повторное сужение просвета артерии после ангиопластики) - введение в сосуд гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в виде плазмидной ДНК. Болезнь Дефектный ген Клетки-мишени Иммунодефицит Аденозиндезаминаза Лимфоциты Семейная гиперхолестеринемия Рецептор липопротеинов низкой плотности Гепатоциты Гемофилия В Фактор IX Фибробласты Эмфизема легких А-1-антитрипсин Лимфоциты Фенилкетонурия Фенилаланин - гидроксилаза Гепатоциты Болезнь Дефектный ген Клетки-мишени Талассемия b- глобин Эритробласты Респираторный дистресс-синдром Сурфактант белок В Эпителий бронхов Болезнь Альцгеймера Белок-предшественник в-амилоида (ААР) Нервные клетки Болезнь Паркинсона Тирозингидроксилаза Миобласты, фибробласты, нервные клетки Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний Принцип Вводимые гены Повышение иммунореактивности опухоли Гены чужеродных антигенов, цитокины Генетическая модификация иммунных клеток Гены цитокинов, ко-стимуляторов Доставка генов «чувствительности», суицидных генов Тимидинкиназа HSV, ген аденозиндезаминазы Блокирование экспрессии онкогенов Антисмысловые РНК, одноцепочечные антитела Доставка генов-супрессоров опухолей р53 Защита интактных клеток от химиотерапии Гены лекарственной устойчивости тип 1 Принцип Вводимые гены Индукция синтеза противоопухолевых веществ нормальными клетками Гены интерлейкина-2, интерферона Продукция противоопухолевых рекомбинантных вакцин Трансфекция дендритных клеток, вакцины типа БЦЖ, экспрессирующие противоопухолевый антиген Локальная радиопротекция нормальных тканей с помощью антиоксидантов Гены трансфераз, глутатион-синтетазы Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний Новые подходы к коррекции генных дефектов: Химеропластика (коррекция ДНК в клетке)Химеропласты - ДНК/РНК гибриды (около 25 нуклеотидов) шпилечной структуры с комплементарными мишени плечами. В гибрид вводится нужная нуклеотидная замена.В ядре клетки происходит гомологичная рекомбинация с исправлением дефекта последовательности.Успешная конверсия в 25-40% клеток. В настоящее время в мире около 400 проектов по генной терапии находятся на различных стадиях клинических испытаний: 261 из них проходит первую стадию (оценка токсичности), 133 - вторую (испытание на небольшой группе тяжелобольных пациентов) и только 3 проекта (два по лечению рака мозга и один по гемофилии) - на заключительной третьей стадии (масштабные клинические испытания). Пока генная терапия применяется в основномв онкологии (более 60% проектов). Примерно по 15% приходится на генную терапию инфекционных (СПИД, гепатит В, туберкулез) и моно генных заболеваний (муковисцидоз, семейная гиперхолестеринемия, мукополисахаридозы, гемофилия А и др.). Новые подходы к коррекции генных дефектов:«Exon-skipping» метод (метод выбрасывания экзона).Введение в клетку коротких антисмысловых последовательностей РНК, комплементарных местам сплайсинга первичного РНК-транскрипта.Проскальзывание петли сплайсинга, захват и выбрасывание из мРНК экзона, несущего мутацию. Генотерапевтические успехи сегодня Редкий синдром Бюргера—Грютца В ЕС эту болезнь будут лечить с помощью внутримышечных инъекций препарата Глибера, созданного голландской фармкомпанией UniQure. Это наследственное заболевание, которое развивается в зрелом возрасте. Внешним его проявлением служат ксантомы — выпуклые желтые пятна на коже. Причина болезни Бюргера—Грютца в том, что ген, который отвечает за синтез фермента липопротеинлипазы, имеет дефект и не справлвется со своей функцией. Препарат Глибера — это «здоровый» ген, который замещает поврежденный в клетках. Положительный эффект, в том числе на отдаленную перспективу, был доказан в клинических исследованиях, проведенных по всем требованиям ЕС. Большого успеха достигли французские ученые и при лечении адренолейкодистрофии — спасли двух семилетних мальчиков. При этом редком заболевании в головном мозге и надпочечниках накапливаются жирные кислоты, поэтому ребенок в течение нескольких лет лишается речи, слуха, зрения, интеллекта, способности двигаться и умирает. Интересно, что в данном случае для исправления генной поломки была использована безвредная разновидность ВИЧ — только такой вектор может проникнуть в стволовые клетки костного мозга. Ярким достижением стало и выздоровление «берлинского пациента», как окрестила пресса американца Тимоти Брауна, много лет живущего в столице Германии. Для пересадки использовать стволовые клетки, в которых есть генетическая мутация, придающая человеку устойчивость к ВИЧ. Первый геннотерапевтический препарат появился на фармрынке Китая. Это Гендецин для лечения чешуйчатого рака кожи. Впервые в мире генная терапия спасла двух детей Впервые в мире заболевание мозга удалось излечить при помощи генной терапии. Результаты первого клинического исследования были опубликованы в престижном журнале Science. Адренолейкодистрофия (АЛД) – тяжелая наследственная болезнь, поражающая одного мальчика из 20 000. В острой форме, являющейся наиболее распространенной, она приводит к разрушению оболочки нервных волокон мозга, проводника нервных сигналов. Патология быстро сказывается на жизненно важных функциях организма и становится причиной смерти больного. После коррекции стволовые клетки вводятся обратно в костный мозг – оттуда они попадают в головной мозг, где выполняют свою функцию. России тоже есть чем гордиться: созданный ее учеными препарат Ангиостимулин с геном, который запускает процесс роста кровеносных сосудов и восстанавливает нормальное кровоснабжение в месте введения, вероятно, скоро появится в арсенале кардиологов. Он показал отличные результаты в клинических испытаниях при ишемии миокарда и нижних конечностей. После применения препарата эффект сохраняется у пациентов не менее чем в течение года. Причем российские ученые не использовали вирусный вектор: они получили требуемую генную конструкцию, выращивая ее на клетках кишечной палочки, а затем выделяя оттуда с высокой степенью чистоты. На территории ЕС впервые разрешено использовать препарат, предназначенный для генной терапии. Alipogene tiparvovec генетически регулирует уровень жиров в крови, излечивая панкреатиты и предотвращая ранние инфаркты и инсульты. Медики надеются, что это лишь начало эры генной терапии, которая выведет лечение на принципиально новый уровень.Препарат Alipogene tiparvovec был разработан для лечения редкой наследственной патологии — недостаточности липопротеинлипазы (ее еще называют гиперлипопротеинемией I типа). При недостаточности этого фермента резко повышается уровень хиломикронов (частиц, участвующих в транспортировке жиров) в крови. В 2006 году ученые из Центра изучения рака Национального института здоровья США (Бетесда, штат Мэриленд) успешно вылечили метастатическую меланому у двух пациентов, изменив генетический материал Т-лимфоцитов и тем самым заставив их атаковать раковые клетки. Медики с помощью генной терапии успешно побороли врожденную слепоту. Восьмилетний ребенок, страдавший врожденной слепотой, был излечен с использованием последних достижений генной терапии, используя индивидуальные для пациента специальные препараты, медики внесли изменения в ген, которые являлись причиной слепоты. Согласно данным издания The Lancet, это является одним из немногих успешных применений генной терапии за все время развития этого направления медицины.

Приложенные файлы

  • ppt 18814371
    Размер файла: 1 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий