biot lek4

Лекція 4
Технологія рекомбінантних ДНК
План
Створення і скринінг бібліотек генів
ПЛР (полімеразно-ланцюгова реакція)
Векторні молекули
Шляхи введення ДНК у клітини. Трансформація.

Мета біотехнологічних експериментів часто полягає в ідентифікації генів, які кодують певні білки (структурних генів). Оскільки у прокаріот кодуючи домени (ділянки) структурних генів безперервні, а у еукаріот кодуючи області (екзони) розділені некодуючими (інтронами), то при їх клонуванні використовуються різні методи. У прокаріот сумарну ДНК гідролізують рестриктазою і кожен з отриманих фрагментів вбудовують у вектор. Потім необхідно виявити специфічну лінію клітин (клон), яка містить необхідну послідовність, відділити її і охарактеризувати. Процес розподілення геномної ДНК на елементи для клонування, введення цих елементів у клітини-господарів має назву створення геномної бібліотеки. Повна бібліотека за визначенням містить весь геном даного організму.
Один із способів створення бібліотеки ДНК полягає в обробці донорської ДНК рестриктазою в умовах, коли відбувається лише часткове розщеплення, таким чином, що створюються фрагменти різних розмірів. Частковий гідроліз дозволяє клонувати цілі гени, однак, оскільки сайти рестрикції розташовані не випадково, деякі фрагменти можуть виявитися занадто великими для клонування. Для вирішення цієї проблеми використовують іншу додаткову рестриктазу.
Фрагменти, що отримані, з’єднують з ДНК векторів за допомогою лігази і, за можливістю, упаковують в підготовлені головки фагових часточок. Бібліотеку зберігають у вигляді фагового банку під хлороформом при t= - 70° С. Таким чином бібліотека здатна зберігатися десятки років.
Для клонування еукаріотичних структурних генів необхідні спеціальні методики. Прокаріоти не здатні видаляти інтрони з первинних РНК-транскриптів, тому правильна трансляція еукаріотичних мРНК у бактеріальній клітині неможлива. Більш того, експресія еукаріотичної ДНК може здійснюватися лише за наявності прокаріотичних сигнальних послідовностей, що регулюють транскрипцію й трансляцію. Кінцеві ділянки еукаріотичних мРНК особливим чином модифіковані: їх 5-кінці кепіровані (містять «кеп» із залишку G, часто метильованого), а 3-кінці поліаденільовані (містять poly(A)-«хвіст» із приблизно 200 залишків аденозину).
Наявність роlу(А)-хвоста дозволяє відокремити мРНК від рибосомної і транспортної РНК. Для цього сумарну еукаріотичну РНК пропускають через колонку, заповнену целюлозою, до якої «пришиті» короткі олігонуклеотидні ланцюжки з тимідинових залишків завдовжки до 15 ланок, oligo(dТ). Роli(А)-хвости молекул мРНК спаровуються із oligo(dТ) і затримуються в колонці, а молекули тРНК і рРНК вільно проходять через неї. У подальшому колонку промивають буфером, у якому відбувається розрив водневих зв’язків між А і Т, та мРНК вивільняється.
Саму мРНК не можна вмонтувати у ДНК-вектор, спочатку на ній необхідно синтезувати дволанцюгову ДНК. Для цього послідовно використовують дві різні полімерази: зворотню транскриптазу й фрагменти Кленова ДНК- полімерази I. Спочатку в реакційну суміш із очищеної мРНК додають короткі oligo(dТ), зворотню транскриптазу й чотири dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Роli(А)-хвіст мРНК спаровується з oligo(dТ), який містить вільну 3-ОН-групу, що ініціює синтез комплементарного ланцюга. Матрицею в цьому синтезі є молекула мРНК, а каталізує його зворотна транскриптаза, що продукується деякими ретро-вірусами. Вона послідовно приєднує до ланцюга, що зростає, залишки Т, С, G або А, комплементарні A, G, С або U мРНК. In vitro синтез ДНК йде не до кінця, при цьому зворотня транскриптаза перед зупинкою звичайно «повертає назад» і приєднує декілька нуклеотидів у зворотному напрямку. А тому в результаті утворюється «шпилька».
У реакційну суміш додають фрагмент Кленова ДНК-полімерази I E. coli, що добудовує другий ланцюг ДНК, використовуючи перший ланцюг як матрицю. Він приєднує дезоксинуклеотиди до зростаючого ланцюга, починаючи з 3-ОН-кінця шпильки. По закінченні синтезу препарат обробляють ферментом PHКазою Н, що руйнує молекули мРНК, і нуклеазою SI, що відщеплює одноланцюгові кінці ДНК. Отриманий препарат являє собою суміш частково й повністю дволанцюгових комплементарних ДНК-копій (кДНК) мРНК, що переважно містилася у вихідному зразку.
Різні кДНК можна вбудовувати в плазмідний вектор і отримати кДНК-бібліотеку.
Ампліфікацію бібліотеки (розмноження) отриманих геномних клонів, а також розшук необхідного клону проводять при зараженні фаговою бібліотекою бактеріальних клітин, які потім висівають на чашках Петрі з агаризованим середовищем. Повний гаплоїдний набір клітин ссавців містить біля 3 · 109 пар основ. При ємності вектору 15 т.п.н. бібліотека може містити біля 1 млн. фагових часточок. Перевірка мільйона фагових бляшок дозволяє перевірити весь геном на наявність необхідного гена. Так можна ідентифікувати певно ті фагові часточкі, які містять послідовність дослідженого гена, розмножити ДНК цієї послідовності і проводити з нею подальші маніпуляції.
Полімеразна ланцюгова реакція. Чисельні (ампліфіковані у мільйон разів) копії певних фрагментів ДНК отримують in vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яку поширено використовують у наш час. Вперш її запропонували у 1985 році Р.К. Сейки, С. Шарф, Ф. Фалуна, К.Б. Мулліс, Г.Е. Хорн, Х.А. Ерліх і Н. Арнхейм. ПЛР високо специфічна і чутлива, за її допомогою можна виявити, розмножити і дослідити навіть одиничну копію гена у вихідному матеріалі. Зазвичай 30 циклів ампліфікації протікає протягом трьох годин.
Для здійснення ПЛР необхідно:
два синтетичних олігонуклеотидних праймери (короткі олігонуклеотиди, що гібридизуються із матрицею і є запалом за її копіювання), завдовжки близько 20 нуклеотидів, комплементарні ділянкам ДНК з протилежних ланцюгів, що фланкирують (оточують) послідовність-мішень, яку розмножують; їх 3-гідроксильні кінці після отжигу (процес утворення дволанцюгових молекул (ДНК-ДНК або ДНК-РНК) з одноланцюгових полінуклеотидних комплементарних ланцюгів) з ДНК повинні бути орієнтовані назустріч один одному;
ДНК-мішень завдовжки від 100 до ~ 35000 п.н.;
термостабільна ДНК-полімераза, що не втрачає активності за температури 95єC і вищої;
чотири дезоксирибонуклеотиди.
Типова ПЛР-ампліфікація складається з багаторазового повторення таких реакцій.
Денатурація. Перший етап ПЛР полягає в тепловій денатурації зразка ДНК витримуванням його за температури 95єC протягом, що найменше 1 хв. Крім ДНК, в реакційній суміші міститься надлишок двох праймерів, термостабільна ДНК-полімераза Тaq, що виділена з бактерій Thermus aquaticus, і чотири дезоксирибонуклеотида.
Ренатурація. Температуру суміші повільно знижують, приблизно до 55єC, при цьому праймери спаровуються із комплементарними послідовностями ДНК.
Синтез. Температуру підвищують приблизно до 75єC – величини, оптимальної для ДНК-полімерази Тaq. Починається синтез комплементарного ланцюгу ДНК, що ініціюється 3-гідроксильною групою праймера (рис. 18).
У першому циклі після денатурації ДНК і зв’язування з нею праймерів ДНК-полімераза створює дволанцюгові структури, в яких батьківські ланцюги ДНК поєднані із знов синтезованими комплементарними ланцюгами різної довжини, але із фіксованим 5-закінченям. Уже у другому циклі створюються два ланцюги специфічної послідовності, що мають задані розміри. У третьому циклі ці ланцюги дають начало дволанцюговим детермінованим за розміром фрагментам ДНК. У кожному наступному циклі їх кількість подвоюється і теоретично досягає за 22 цикли, а на практиці – за 30 циклів більше мільйона копій. Вихідні молекули ДНК і структури, що створилися у першому циклі, присутні в реакційній суміші наприкінці ПЛР у незначній кількості.
Для здійснення ПЛР необхідно знати послідовність як найменш 17 п.н. з обох боків дослідного фрагменту ДНК. Зазвичай синтезують два дезоксинуклеотиди довжиною 2030 основ, які являють собою кінцеві послідовності фрагменту ДНК, що нас цікавить. Використовуючи комплементарні до цих ділянок олігомери – праймери, запускають ампліфікацію (процес збільшення копій гену). Надлишкову кількість праймерів змішують з геномної ДНК, а потім послідовно здійснюють реакції денатурації, випалу (ренатурації) і нарощування ланцюга (подовження праймера). Теплова денатурація супроводжується розплітанням подвійної спіралі ДНК. За зниження температури має місце випал олігонуклеотидів, тобто здійснюється гібридизація олігонуклеотидних праймерів із своїми комплементарними послідовностями. Ріст ланцюга праймерів каталізує ДНК-полімерза в присутності дезоксирибонуклеозидтрифосфатів, і в результаті добудовується новий комплементарний ланцюг ДНК.


Рис. 18. Схема полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР): а – ДНК-мішень, б – праймер у ПЛР, в – нова ДНК, г – напрямок ампліфікації, дс – денатурація і синтез

За повторних циклів теплової денатурації, випалу і синтезу нові ланцюги ДНК, що утворилися, є шаблонами (матрицями) для праймерів, що викликає експоненціальне нарощування ділянки ДНК, обмеженої праймерами, що входять до складу цих фрагментів.
У разі ампліфікації геномної ДНК з клітин (тканин) хребетних тварин інколи відбувається накопичення фрагментів нез’ясованого походження. Тоді здійснюють серію додаткових ампліфікацій, використовуючи інший набір олігонуклеотидних праймерів.
На перших етапах використовували в ПЛР так звані фрагменти Кленова ДНК-полімерази І Е. соlі, які виявилися термолабільними, і після кожного циклу денатурації необхідно було додавати нову порцію ферменту. Крім того, за пониженої температури випалу знижувалася специфічність ампліфікації.
Після виділення термостабільних ДНК-полімераз, зокрема, з бактерій Thermus aquaticus (Taq-полімераза) суттєво збільшилася ефективність ПЛР. Taq-полімераза зберігає активність після теплової денатурації ДНК і не виникає необхідності замінювати фермент після кожного циклу. Температурний оптимум реакції становить 7075°C, що значно підвищує специфічність, кількісний вихід і можливу довжину копій фрагментів ДНК, що амплифікуються.
Успіх певної ПЛР суттєво залежить від правильного вибору праймерів. Для мінімізації можливості неправильного спарування, праймер повинен відповідати деяким вимогам. Його довжина має бути 1730 нуклеотидів за вмісту GC-пар близько 50%. Чим менший вміст GC-пар у праймері, тім більшою повинна бути його довжина. Необхідно запобігти появі вторинних структур у праймері і більше трьох-чотирьох однакових нуклеотидів підряд. Праймери, що використовуються в одній реакції, не повинні мати комплементарні ділянки.
Область використання ПЛР велика і постійно розширюється: діагностика генетичних захворювань; виявлення генетичного матеріалу патогенних мікроорганізмів у клінічних зразках; синтез зондів для гібридизації; створення бібліотек кДНК (копійних ДНК) з малої кількості мРНК; мультиплікація ДНК з метою секвенування; спрямований мутагенез та ін.
Наступний після створення бібліотеки етап - це розшук клону (клонів), які містять необхідну послідовність ДНК. Для цього використовують три методи: гібридизацію з міченим ДНК-зондом з наступним радіоавтографічним аналізом; імунологічний скринінг (ідентифікація одиничного об’єкту шляхом перевірки чисельних об’єктів); скринінг за активністю білку, який кодується геном – мішенню.
Скринінг за допомогою гібридизації. Необхідну нуклеотидну послідовність у зразку ДНК можна виявити за допомогою ДНК-зонду, який з’єднується лише з послідовністю, що розшукується.
ДНК-гібридізація полягає в тому, що ДНК-мішень піддають денатурації (роз’єднанню ланцюгів ДНК під дією теплової обробки або впливу лугів) і одноланцюгові молекули міцно приєднують до твердої підложки (нітроцелюлозного або нейлонового фільтру). Потім фільтр інкубують з одноланцюговим ДНК-зондом, який помічений радіоізотопами або іншими мітками. Якщо нуклеотидні послідовності зонду і ДНК-мішені комплементарні, то відбувається їх спарування (тобто гібридизація). Гібридні молекули можна виявити радіографічним або іншими методами. Для гібридизації необхідно, щоб на ділянці довжиною 50 нуклеотидів співпадало більш 80% з них.
Мічені ДНК-зонди для скринінгу бібліотеки можна отримати як найменш двома способами. По-перш, можна використовувати клоновану ДНК близькоспорідненого організму (гетеролітичний зонд). По друге, зонд можна отримати методом хімічного синтезу, заснованого на відомій амінокислотній послідовності білкового продукту гену, який розшукується.
Блот-гібридизація. За створення клонотек генів хромосомну ДНК розрізають на фрагменти за допомогою рестриктаз. При цьому невідомо, чи містить ген, що розшукується, сайт або сайти розщеплення певної рестриктази. Якщо такі сайти є, то виділити цілий ген не вдається, і тому треба використовувати іншу рестриктазу. Однак, ще попередньо, без клонування у бактеріях, можна досліджувати структуру індивідуальних генів, визначити в них наявність тих чи інших сайтів рестрикції, встановити число копій даного гена у геномі. Метод блот-гібридизації, що використовується для цього, потребує наявності відповідної мРНК або кДНК.
Аналіз здійснюють таким чином (рис. 29). Високомолекулярну хромосомну ДНК розщеплюють рестриктазою або їх набором. Фрагменти, що створилися, розподіляють за довжиною електрофорезом в агарозному гелі, і гель поміщають на лист нітроцелюлози. Після цього напрям електрофорезу змінюють перпендикулярно (у напрямку листа). При цьому ДНК з гелю переходить на нітроцелюлозу і створюється репліка із гелю. Надалі здійснюють гібридизацію на фільтрі фрагментів хромосомної ДНК із зондом. Зонд гібридизується лише з тими фрагментами (смугами), що містять відповідний до нього ген. Смуги, у яких зв’язалася мітка, виявляють радіографією.
Наявність на автографі однієї смуги свідчить про те, що під час рестрикції ген не розщеплюється, а інтенсивність смуги дає можливість визначити кількість копій гена у геномі.
Імунологічний скринінг. При відсутності ДНК-зонду можна використовувати інші методи, наприклад, якщо клонований ген здатний до експресії (реалізації генетичної інформації), то його продукт – весь білок, або його частину – можна виявити імунологічними методами. Всі клітинні лінії (клони) бібліотеці висівають на чашки з поживним середовищем. Колонії, що виросли, переносять на фільтр, клітини лізірують (руйнують), а білки, що звільнилися, фіксують на фільтрі. Після цього на фільтр наносять перші антитіла, які специфічно зв’язуються з певним білком (антигеном); усі антитіла, що не зв’язалися віддаляють, а фільтр поміщають у розчин других антитіл, специфічних до перших антитіл. Часто використовують кон’югати других антитіл з ферментом, під впливом якого відбувається гідроліз субстрату з утворенням забарвленої речовини в тому місті, де здійснюється реакція.
Скринінг за активністю білку. В тому випадку, коли ген, що розшукується, кодує фермент, який не синтезується клітиної-господарем, використовують метод ідентифікації на чашках. Для виявлення клонів, які містять цей ген, клони Е.соІі, що складають геномну бібліотеку даного організму (клітини-господарі), висівають на середовищі із специфічним субстратом. Клітини, які здатні утилізувати цей субстрат, після фарбування набувають певного забарвлення.
Якщо ген, що розшукується, кодує продукт, без якого клітина-господар не здатна рости на мінімальному середовищі, то бібліотеку можна створювати методом трансформації мутантних клітин. Клони, що не містять цього гену будуть гинути, а на мінімальному поживному середовищі залишаться лише клітини, до складу яких увійшов необхідний ген.
Введення у клітину і стабільна підтримка генетичної інформації, що міститься у рекомбінантних молекулах ДНК, досягається за допомогою векторних молекул, або векторів. Векторами називають молекули ДНК, які здатні акцептувати (включати в себе) чужорідну ДНК і забезпечувати її реплікацію, експресію і/або трансформацію (переніс у інші організми). Таким чином, вектор дозволяє здійснити введення у клітину додаткової генетичної інформації. В якості векторів використовують, як правило, плазміди, бактеріофаги, мобільні елементи, віруси тварин. В наш час створено значна кількість векторів, які розрізняють за профілем їх використання на декілька типів.
Вектори для клонування. Використовують для ампліфікації (збільшення кількості) шляхом реплікації фрагменту ДНК, що вбудований у такий вектор. Для цього найчастіше використовують бактеріальні плазміди і фаги. Для клонування великих фрагментів геному використовують вектори – штучні бактеріальні і дріжджові хромосоми (ВАС і YАС).
Вектори експресії. Їх використовують для аналізу певних послідовностей генів і білкових продуктів, а також для наробки певного білку. Існує значна кількість систем експресії, особливо для прокаріотичних організмів. Є, також, вектори для експресії генів у клітинах дріжджів, рослин і тварин. Вектори експресії для еукаріот завжди містять промотор, здатний працювати у даному типі організму і сайт поліаденілірування (роlу(А) – хвіст), який складається приблизно з 200 залишків аденозину. Наявність роlу(А)- хвосту дозволяє відокремити матричну - мРНК від рибосомальної – рРНК і транспортної - тРНК, а також надає можливість приєднання олігомерів oligo(dТ), які ініціюють синтез комплементарних ДНК-копій (кДНК) на підставі мРНК за допомогою рестриктази.
Вектори для трансформації. Використовують для введення чужорідного фрагменту ДНК у геном реципієнту. Як правило, такі вектори містять специфічні послідовності, які сприяють інтеграції у геном.
Сучасні векторні системи в основному бувають поліфункціональні і об’єднують декілька функцій в одному векторі. Часто у складі векторів існує маркерний ген, який після проникнення вектора у клітину надає їй фенотип, який свідчить про наявність у клітині вектору. Тобто бажано щоб вектор мав селективну генетичну ознаку. Такими ознаками буває стійкість до антибіотиків, до іонів важких металів, температурна стійкість.
У цілому до векторних молекул висувають наступні основні вимоги:
1) вектор повинен мати унікальні сайти рестрикції для декількох рестриктаз (в найкращому випадку по одному для кожної), що надає можливість вбудувати в нього фрагмент чужорідної ДНК;
2) вектор повинен володіти певною ємністю і не виключати вбудований фрагмент;
3) вектор повинен бути репліконом, тобто здатним до реплікації, в певних клітинах за рахунок послідовності початку реплікації або власної, або клітини-господаря;
4) вектор повинен містити послідовність маркерного гену, за допомогою якої можливо здійснити селекцію клітин з векторною конструкцією.
Векторні конструкції з чужорідним геном, що отримані, використовують для трансформації бактеріальних клітин спеціальних штамів Е.соІі.
Трансформація – це процес переносу генетичної інформації, при якому ДНК, що виділена з клітини-донору, потрапляє у клітину-реципієнту. Трансформація може відбуватися як хромосомною, так і плазмідною ДНК. Процес, при якому в бактеріальні клітини потрапляє виділена ДНК фага і зумовлює утворення в них зрілих фагових часточок, має назву трансфекція.
Мікроорганізми не завжди здатні до трансформації. Трансформуються лише компетентні клітини, які здатні адсорбувати і поглинати ДНК. У багатьох бактерій компетентність виникає лише на певному етапі росту культури – в стадії компетентності.
Один з найважливіших етапів генетичної трансформації – це перенесення молекул ДНК через оболонку клітини. На стан компетентності клітин впливають різні фактори зовнішнього середовища. До них належать температура, рН, іони важких металів, осмотичний тиск та ін.
Компетентні клітини відрізняються від некомпетентних зміною властивостей клітинної оболонки. В них знижений поверхневий заряд, підвищена чутливість до осмотичного шоку. Мікроорганізми, в яких відсутня природна компетентність також можуть бути трансформовані. Для цього клітини оброблюють тим чи іншим способом, для ініціації в них здатності до поглинання ДНК. Найбільш поширений метод індукції компетентності у клітин Е.соІі – це обробка крижаним розчином СаСl2. Використовують також спосіб глибокого заморожування з наступним відтаюванням клітин, що забезпечує збільшення проникності для фагової, плазмідної і хромосомної ДНК. Метод має назву кріотрансформація. Для підвищення проникності клітинних мембран на них впливають електричним струмом. Ця процедура називається електропорація. Умови її проведення різні для різних видів бактерій. При роботі з Е.соІі клітинну суспензію і ДНК розміщують в посудині з зануреними електродами і подають поодинокий імпульс струму. Після цього ефективність трансформації покращується до 109 для коротких плазмід (приблизно 3 т.п.н.) і до 106 для великих (приблизно 135 т.п.н.).



15

Приложенные файлы

  • doc 19095922
    Размер файла: 85 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий