otvety na zachet po prakt navykam


Вопрос 1.
Указать принципы, на которых основывается выбор материала для исследований. Первый этап любого микробиологического исследования составляет правильный выбор материала для исследования.
Его определяют свойства возбудителя и патогенез вызываемого им заболевания. При поражениях отдельных органов и систем целесообразно отбирать материал соответствующей локализации.
При отсутствии поражений исследуют кровь, а затем отбирают образцы с учётом клинической картины заболевания и доступности материала для исследования.
Так, при лихорадке неясного генеза первоначально проводят посев крови; затем, при появлении симптомов более конкретных проявлений, например пневмонии, проводят забор мокроты.
Образцы следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для предупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабораторию.
Выбор материала для исследования должен соответствовать характеру инфекционного процесса. Так, например, при установлении этиологии пневмонии материалом должна быть мокрота, а не слюна, а при раневых инфекциях, отделяемое следует забирать из глубины раны, а не с её поверхности.
Вопрос 2
Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводится по следующим направлениям:
обнаружение возбудителя заболевания в патологическом материале
обнаружение специфических антител в сыворотке крови больного (серологическая диагностика)
выявление у больного повышенной чувствительности к возбудителю с помощью аллергических проб .Обнаружение и идентификацию возбудителя заболевания проводят используя микроскопический, микробиологический и биологический методы. Микроскопический метод используется для обнаружения возбудителя непосредственно в патологическом материале. Может применяться как самостоятельный метод в отношении некоторых микроорганизмов с характерной морфологией. С помощью микроскопического метода можно сделать заключение при обнаружении гонококков в гное, менингококков в спинномозговой жидкости, палочек туберкулеза, а также простейших: плазмодиев малярии, лейшмании, дизентерийной амебы. Микроскопия применятся как обязательный этап исследования при микробиологическом методе.
Микробиологический метод применяется для выделения чистой культуры микробов и их идентификации по ряду признаков:морфологии, способности окрашиваться красителями, характер роста на пит средах, биохимическим свойствам и по антигенной структуре. Для эпидемиологического анализа проводят внутривидовую идентификацию - определение серовара, фаговара, биовара.
Для экспресс- диагностики применяют РИФ со специфическими сыворотками. Метод позволяет выделить возбудителя в течении несколько часов. В последнее время для идентификации микробов применяю методы основанные на исследовании состава ДНК (ПЦР)
Биологический метод основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают. Органы исследуют гистологически, микроскопически для обнаружения в них возбудителя.
. Способность бактерий дифтерии продуцировать токсин устанавливают в реакции преципитации в агаре.Для этого в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15- 20% лошадиной сыворотки, 0.3% мальтозы и 0.3% цистина кладут полоску фильтровальной бумаги,пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл, Чашку подсушивают при 37 градусах в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0.6-0.8 см от края бумаги.В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру.Посевы инкубируют при 37 градусах до следующего дня.При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксинов плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий-«усов».В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительные пробы на цистиназу, уреазу и реакцию агглютинации с агглютинирующей дифтерийной сывороткой.
Серологические методы направлены для выявления специфических антител в сыворотке крови пациента. С целью выявления динамики нарастания титра антител исследуют парные сыворотки, полученные от пациента в начале болезни и через 1-3 недели.
Аллергический метод. Применяется для выявления повышенной чувствительности к возбудителю путем постановки внутрикожных проб с аллергеном
Вопрос 3.
Описать принципы микроскопии с использованием фазово-котрастного микроскопа.
Метод фазового контраста предназначен для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.
Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
Набора объективов со специальными фазовым пластинками; Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.
Настройка фазового контраста заключается в следующем:
Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph);
Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "О");
Настраивают свет по Келеру;
Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;
Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;
Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п.
Вопрос 4.
Принципы микроскопии с использованием темнопольного микроскопа.
Темнопольная микроскопия(темновая) - используется за наблюдением за движением бактерий. Применяется боковое освещение - получается светящийся объект на тёмном фоне (бактерии - плотные частицы отражают боковой свет).
Стёкла должны быть очень чистыми и определённой толщины (предметные - не более 1,2 мм, покровные - 0,17 мм).
Готовят препараты по типу «раздавленная капля» или «висячая капля». Настройка темнопольного освещения:
устанавливают свет по Келеру;
заменяют светлопольный конденсор темнопольным;
на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;
поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;
объектив малого увеличения фокусируют на препарат;
спомощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);
поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна. Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла). После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.
Метод приготовления препарата для темнопольной микроскопии,фазово- контрасной и люминесцентной:
Готовят нативный препарат ( раздавленная капля)
Микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом. Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1.5 мм, покровных - 0.15-0.20 мм Для люминесцентной микроскопии препарат окрашивают специальными флуоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином.
При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.
Вопрос 5.
Методика обнаружения бактериофага в исследуемом материале:
Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой питательной среде)
Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1 пробирку добавляют 0,5 исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10"' до 10"9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бфага принимают то его макс разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).
Метод титрования бфага по Грация (на плотной питательной среде) Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3-4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бфага в изотоническом р-ре. Затем 0,5 мл каждого разведения бфага смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром t=45 С. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37 С в течение суток. Смеси бфага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 10210!и, в зависимости от предполагаемого титра фага. Не зараженные бфагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара. Каждая инфицированная бфагом бактерия лизируегся и освобождает потомство бфага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса кл на сплошном бактериальном газоне появляютя «стерильные» пятна или негативные колонии бфага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бфага называется его титром.
Вопрос 6.
6.Описать принципы определения состава и количества микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека.
Мутуализм (лат. rautuus - взаимный) - взаимно полезное сожительство. Например, для человека полезными симбионтами являются молочнокислые бактерии - антагонисты гнилостной микрофлоры кишечника.
Комменсализм (фр. commensal - сотрапезник) - сожительство, односторонне полезное для одного из симбионтов, не причиняющее вреда другому. Например, комменсалом человека является непатогенная кишечная амеба, питающаяся остатками пищии не причиняющая человеку вреда. Эти две формы симбисва характерны для нормальной микрофлэры организма здорового человека. Для микроскопического исследования берут мазки из зева, мазки из зубного налета, ватным тампоном, смоченным в физ. растворе с запястья ладоней.
Микрофлора кожи. На поверхности кожи обитают, главным образом, транзиторные микробы: сарцины, стафилококки, коринебаюерии; в глубоких слоях кожи постоянным обитателем является эпидермальный стафилококк. Кожа, в особенности чистая, обладает бактерицидностью благодаря действию выделений потовых и сальных желез.
Полость рта наиболее богата по разнообразию видов бактерий, грибов, простейших, вирусов. Постоянные обитатели способны к адгезии - прикреплению к поверхности зубов или слизистой оболочки. Состав микрофлоры зависит от состояния организма, от состава пиши, от гигиены полости рта.
Микрофлора дыхательных путей. Микроорганизмы, содержащиеся во вдыхаемом воздухе, большей частью погибают в полости носа. Постоянными обитателями здесь являются микрококки, стафилококки, дифтеранды, нейссерии. Трахея и бронхи свободны от постоянной микрофлоры. Характеристмся микрофлоры оргатзма человека
Микрофлора организма человека является результатом взаимного приспособления в процессе взаимодействия микроорганизмов и хозяина. Все многообразие микробов, встречающихся в организме человека, можно условно разделить на три группы:
Транзиторюя микрофлора - микробы, случайно попавшие в организм, не имеющие приспособлений для выживания в км.
Резидентная микрофлора - микробы постоянно живущие, приспособившиеся к существованию в определенных областях органнзш, преимущественно полезные для него.
Условно-патогенные, способные вызвать заболевание при ослаблении сопротивляемости организма, при нарушении нормальной микрофлоры.
Организм ребенка при рождении свободен от микробов, но уже в процессе родов и в первые дни жизни микробы заселяют поверхность тела, ротовую полость, дыхательные пути, кишечник. В дальнейшем при взаимодействии микробов с организмом ребенка, в результате взаимной адаптации одни микробы будут удалены, другие приживутся. При этом для каждой области организма характерны определенные виды.
Свободны от микрофлоры кровь и внутренние органы, не сообщающиеся с внешней средой, такие как мозг, сердце, печень, селезенка и другие В норме не имеют резидентной микробной флоры такие органы, как матка, мэчевой пузырь, легкие.
Вопрос 7.
Вопрос 8.
Принципы определения бактерицидной активности кожи
Берется соскоб с кожи предплечья (внутренняя поверхность) или плеча и делается посев на питательный агар с микрококками. Заключение ставится по лизису микрококков.
На внутреннюю поверхность предплечья наносится суточная бульонная культура E.coli, разведенная в 5х104. Сразу после нанесения , а также через 5,10,15 минут ,с разных участков контаминированной кожи делают отпечатки на стекла, покрытые тонким слоем среды Эндо или МП А. Стекла выдерживают сутки в термостате при 37°, подсчитывают число колоний красного цвета и делают перерасчет на 1см2 поверхности. Выражают в виде индекса бактерицидности. (антагонизм нормальной микрофлоры).
Посмертный срез кусочка кожи.
С помощью стандартных полосок (накладываются на кожу предплечья).
Вопрос 9.
Описать принципы определения вида и уровня Ig в биологическихжидкостях.
Постановка РСК (реакции связывания комплемента) с целью дифференцирования IgM и IgG.
Серологические реакции могут быть использованы для ориентировочного определения принадлежности специфических антител к одному из основных классов иммуноглобулинов: IgM или IgG. Возможность дифференцировать эти два класса иммуноглобулинов основана на их различной чувствительности к действию 2-меркаптоэтанола, цистеина и других редуцирующих веществ, которые вызывают разрывы дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на субъединицы, лишенные антительной активности.
Под действием той же концентрации 2-меркаптоэтанола молекулы IgG сохраняют свою целостность и антительную активность. Исходя из этого составляют серологическую реакцию (РСК или РТГА )с используемой сывороткой: нативной и обработанной 2-меркаптоэтанолом. При первичной инфекции гуморальный ответ начинается с синтеза IgM, а при рецидиве инфекции на повторную встречу с тем же антигеном ИС отвечает синтезом преимущественно IgG.
Снижение титра специфических антител в исследуемой сыворотке в результате обработки 2-меркаптоэтанолом свидетельствует в пользу первичной инфекции.
Вопрос 10.
УКАЗАТЬ ПОРЯДОК ДЕЙСТВИЙ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПРЕПАРАТА «ВИСЯЧАЯ КАПЛЯ».
Метод «висячей капли». Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40 и исследуют препарат.
Вопрос 11.
Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают её покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40.
Вопрс 12.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.
Отношение бактерий к окраске по Грамму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый(мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комплекс протеин- рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8:1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1:1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при ph 2,0-3,0, у грамотрицательных -около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем. Происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени , чем у грамотрицательных. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.
Окраска по Грамму имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактерия относятся стафилококки, стрептококки,коринебактерии дифтерии,микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным- гонококки , менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Грамму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.
Вопрос 13.
Перечислить виды микроорганизмов, окраску которых необходимо производить по способу Циля-Нильсена: метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры, актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Вопрос 14Характеристика культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Эндо, указать последовательность дальнейшего исследования.
Среда Эндо: выпускается в виде порошка, который состоит из
высушенного питательного агара с 1% лактозы
индикатора - основного фуксина, обесцвеченного сульфитом Na Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри. Свежеприготовленная среда практически бесцветна.
При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные колонии.
Вопрос №15
С целью получения изолированных колоний произвели посев на среду Плоскирева, термостат 37 градусов/сутки.
СРЕДА ПЛОСКИРЕВА - дифференциально-диагностическая и селективная, способствует лучшему росту некоторых бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерий) и подавляет рост других (кишечная палочка и пр.). Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Лактозоотрицательные колонии вырастают бесцветными, лактозоположительные - красными. На некоторых модификациях среды Плоскирева выявляется еще и способность сальмонелл выделять сероводород: выросшие колонии чернеют. Далее готовим мазок, окрашиваем по Грамму, микроскопирум (При дизентерии наблюдаем рост бесцветных колоний, при микроскопировании - грамотрицательные палочки, расположенные беспорядочно. Для постановки предварительного диагноза ставим реакцию агглютинации с типовыми сыворотками и смотрим результат.)Вопрос 16.
Дать характеристику культуралъных свойств микроорганизмов, выросших на среде Левина и указать последовательность дальнейшего исследования.
Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий на питательных средах.Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культур. Среда Левина является диф.-диагностической, т. е. применяется для разграничения отдельных видов микроорганизмов. Ее состав: питательный агар с лактозой, К2НР04, метиленовый синий и эозин.Имеет темно-фиолетовый цвет. Лактозоположительные бактерии образуют колонии синего цвета, лактозоотрицательные - бесцветные. Дальнейшее исследование: выделение чистой культуры.Для этого просматривают чашки, обращают внимание на форму, величину и консистенцию выросших колоний. Делают мазок, окрашивают, микроскопируют. Для выделения чистой культуры изолированную колонию пересевают в пробирки со скошенным агаром. Отмечают характер роста выделенной чистой культуры (чаще характеризуется однородным ростом, при микроскопии обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки ).
Вопрос № 17
Дизентерия на среде Пловкирева - смотри выше.
СРЕДА ЭНДО предназначена для выделения энтеробактерий, обнаружения эшерихий. Состоит из питательного агара, 1% лактозы и индикатора - основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные кишечные палочки образуют бесцветные колонии. Колиэнтерит: произвели посев на среду Эндо с целью получения изолированных колоний методом штриха по секторам,t=37C/cyTKH. На среде Эндо наблюдается рост колоний красного цвета с металлическим блеском.
Вопрос 18.
Вопрос 19.
Вопрос 20.
Посев выделенной чистой культуры бактерий на среды для изучения б/х свойств
Посев на среды Гисса(для определения способности ферментировать углеводы), на среду Олькеницкого (ферментация углеводов, протеолитическая способность, мочевина)-на поверхности среди штрихами и укол в столбик..
Вопрос 21.
Оценить результаты исследования ферментативной активности бактерий на среде Олькеницкого и указать последовательность дальнейшего исследования.Среда Олькеницкого готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу(1%), сахарозу(1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расплавленном виде оставляют застывать в таком виде, что бы получился столбик и скошенная часть. Посев производят штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большом количестве (лактозы, сахарозы или обеих Сахаров) изменяется цвет всей среды; при сбраживании глюкозы изменяется только цвет столбика а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков газа в столбике агара. Оцениваем результат. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий расщеплять белки с образованием сероводорода, что определяется по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета. Дальнейшие действия. Если произошло выделение H2S, произошел разрыв в толще агара, произошло почернение, то мы можем судить о наличии сальмонелл, и далее производим реакцию агглютинации.
Вопрос №22
СРЕДЫ ГИССА дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий (кишечной группы). Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 - бесцветна, при ферментации углеводов приобретаетйкрасный цвет . В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.
Вопрос 23.
Произвести дифференцировку биовариантов холерного вибриона по биологическим свойствам (чувствительность к полимиксину, чувствительность к специфическому бактериофагу, реакция фогес-проскауэра, гексаминовый гест, гемолиз эритроцитов барана).
Тест Классический холерный, вибрион Холерный вибрион Эль-Тор Неагглютн- нирующнесм вибрионы
Агглютинация О-сывороткой+ +
Агглютинация типовыми сыворотками Огава и Инаба+ + —
Лизис фагами: холерный фаг С (фаг IV) + — ±
фаг Эль-Тор II — + ±
Агглютинация куриных эритроцитов — + ±
Гемолиз эритроцитов барана — ± ±
Рост иа агаре с 50 ЕД полимиксина— + ±
Гексаминовый тест — + ±
Реакция Фогеса — Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) + ±
Условные обозначения: Ч- наличие признака; — отсутствие признака; ± признак непостоянный.(19)Дать характеристику культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Китта-Тароцци и стерильном молоке, указать последовательность дальнейшего исследования: Среда Китта-Тароцци обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Ее используют для культивирования и хранения клостридий. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удалений воздуха. После посева среду заливают
небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды.
Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерии на плотных и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.
Вопрос 24.
Учесть рост и описать культуральные свойства коринебактерий дифтерии на среде Клауберга.
Среда Клауберга содержит свернутую сыворотку и теллурит калия. Коринебактерии дифтерии биовара гравис образуют крупные серые колонии с неровными краями и радиальной исчерченностью («цветок маргаритки»), биовар метис — мелкие черные колонии с ровными краями, биовар интермедиус — промежуточные колонии, влажные серого или коричневого цвета или мелкие сухие колонии.
Вопрос №25
СРЕДА ЛЕВЕНШТЕИНА-ИЕНСЕНА применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Это плотная яичная среда с добавлением картофельной муки, глицерина малахитовой зелени, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают на 15 — 25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.
Культура Mycobacterium tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена. Микобактерии растут в виде типичных морщинистых колоний кремового цвета на зеленом фоне яичной среды.
Вопрос 26Определение факторов патогенности стафилококков:
Лецитовителлаза (лецитиназа) наличие лецитиназы при посеве культуры на желточно-солевой агар. Через сутки вокруг колоний появляются зоны помутнения с радужным ореолом.
Плазмокоагулаза: выполняют посев культуры на цитратную плазму, после инкубации 18-24ч появляется студнеобразный сгусток коагулированной плазмы - коагулаза (+)Гемолизин - наличие зон бета- или альфа - гемолиза вокруг колоний на кровяном агаре.
Вопрос 27.
Учесть результаты опыта по определению фаготипа и фагогруппы штамма стафилококка.
Фаготипирование проводят с помощью набора типовых стафилофагов, устанавливая идентичность фаготипов. Фаги разводят до титра, указанного на этикетке. Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, подсушивают, а затем петлей наносят по капле каждого фага на 22 квадрата, предварительно намеченных карандашом на дне чашки Петри, Посевы инкубируют в термостате при 37С. Результаты оценивают на след. День по наличию лизиса культуры в квадратах.
Вопрос 28. Указать последовательность определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом стандартных дисков и оценить результаты.
Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри, после чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определённые дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37С до следующего дня. По диаметру задержки зон роста культуры стафилокока судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста диаметром до 10 мм культура расценивается как малочувствительная, а свыше 10 мм- как высоко чувствительная. В том случае, если диски пропитаны разными концентрациями одного и того же антибиотика, можно установить наименьшую дозу препарата, к которой чувствительна исследуемая бактериальная культура.
Вопрос 29.
Рассчитать фагоцитарные показатели и дать оценку состоянию фагоцитарного звена иммунной защиты организма. Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток. ФАГОЦИТАРНЫЙ показатель-— число микробов, поглощенных одной фагоцитирующей клеткой. Количественную оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов проводят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют частицы латекса диаметром 1.0 - 2.0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.
Фагоцитирующие клетки смешивают с объектами фагоцитоза и в соотношении 1:100 или 1:10 и инкубируют при 37° в течение ЗОмин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май- Грюнвальда и окрашенных по Романовскому- Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток - фагоцитарный показатель и среднее число частиц, поглощенных одной клеткой - фагоцитарное число. Норма: фаг. показатель 40-80% Фаг. число 1-5.
Вопрос 30.
Учесть результат реакции связывания комплемента: реакция комплемента (РСК) ставиться в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител, и добавляют комплемент, инкубируют в термостате ЗОмин или 18-20 часов в холодильнике.
Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение ЗОмин. учитывают результат.
Про положительной РСК антител сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антитела в исследуемой сыворотке нет),комплемент остается свободным, и произойдет гемолиз.
РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонореи, сыпного тифа и других заболеваний.
РСК можно применить и для определения антигела, например, вируса. В этом случае в качестве антител применяется диагностическая иммунная сыворотка. В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана.
Вопрос 31.
Дать характеристику методике определения гиперчувствительности замедленного типа.Гиперчувствительность замедленного типа. ГЧЗТ связана не с антителами, а с иммунными лимфоцитами - Т-эфекторами (Те). Это Т-зависимая аллергия. К данному типу аллергии относитися инфекционная аллергия. Наблюдается она при туберкулезе, бруцеллезе, туляремии, токсоплазмозе, грибковых заболеваниях. Аллергические пробы используют в диагностических целях. Аллергены, полученные из микробов, вводят внутрикожно или накожно. При наличии повышенной чувствительности к возбудителю через 24-48-72 часа развивается воспалительная реакция. Диагностические аллергические пробы применяются при туберкулезе (реакция Манту с туберкулином), при бруцеллезе, сибирской язве и др.
Контактная аллергия. Повышенная чувствительность аллергического характера к лекарственным препаратам связана с выработкой антител или иммунных лимфоцитов. Это явление существенно отличается от обычного усиления фармакологического действия лекарственного препарата.
Вопрос 32.
Из выросших изолированных колоний кишечной палочки отбирают те,которые агглютинируются диагностическими ОВ- сыворотками. Пересеивают их на скошенный агар, выделяют чистую культуру и затем определяют серовар в развернутой реакции агглютинации с живой культурой (В- агглютинация) и прогретой кипячением культурой (О- агглютинация). Учет производится по титру (т.е. положительному результату в виде склеивания и оседания на дно пробирки иммунных комплексов в виде хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом).
Вопрос 33.
При работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами применяют реакцию непрямой, или пассивной, гемаггпютинации (РПГА). Антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах, готовят эритроцитарный диагностикум. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену(РПГА). Реакция отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемых сыворотках. При необходимости обнаружения антигена в исследуемом материале эритроциты предварительно нагружают специфическими антителами и также ставят РПГА. При помощи РПГА определяют полные(бивалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этим методом, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его,но не могут вызвать агрегации частиц в крупные конгломераты.
Рекцию используют либо для выявления специфических антител в сыворотке больного при серодиагностике, либо для идентификации неизвестного возбудителя или индикации его антигенов в исследуемом материале. Соответственно используют стандартные(коммерческие) эритроцитарные диагностикумы или суспензионные антитела, полученные путем сенсибилизации обработанных танином(танизированных) эритроцитов антителами. В лунках с пластмассовых пластин готовят поледовательные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждукю лунку вносят одинаковый объем ^(0,05 мл) 3% суспензии нагруженных антигеном эритроцитов^ соответствующего эритроцитраного диагностикума. Через 2 часа инкубации при 37 градусах учитывают результат, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): отрицательный- осадок эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными краями на дне лунки, положительный- характерный кружевной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями. Серодиагностика шигелл. Применяется для ретроспективного обоснования диагноза дизентерии при стертых формах, а также для уточнения вида возбудителя. Ставят реакцию агглютинации по типу реакции Видаля и РПГА с эритроцитарным диагностикумами Флекнери и Зоне. Диагностическим титром при дизентерии,вызванной шигеллами Флекснера, считают разведение 1:200, а шигеллами Зонне- 1:100. *В тетради записалипо этой теме: для определения вида шигелл поставили реакцию агглютинации на стекле с видовыми сыворотками флекснери и зот. Выделена шигеллаВопрос 34.
УЧЕСТЬ РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ.
Реакция преципитации-это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку медленно по стенке наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Вопрос 35.
Поставить и учесть реакцию агглютинации на стекле выделенной чистой культуры с противодизентерийными сыворотками.
Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, а на другую - каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2-4 минут. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютината в каплях. Учет производят через Т-5 минут. Сыворотки Флехнер и Зонне.
Вопрос 36.
Вопрос 37.
РТГА (реакци^торможения гемагглютинации) основана на том, что при взаимодействии вирусных АГ гриппа со специфическими AT сыворотки происходит блокирование гемагглютинирующей способности вируса, т.е. торможение гемагглютинации. При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска с ровными краями. Титр AT определяют по последней лунке с положительной РТГА. Для постановки реакции РТГА для серодиагностики гриппа берем парные сыворотки. В первой сыворотке титр 1:4(т.к это последняя лунка с положительной РТГА), во второй сыворотке титр 1:32. (т.к это последняя лунка с положительной РТГА) Наблюдается нарастание титра сыворотки в 8 раз (диагностическим считается нарастание титра в 4 раза).
Вопрос 38.
Произвести учет ретроспективной РТГА с целью серодиагностики гриппа.
Серологическое исследование является ретроспективным методом исследования, то есть диагноз может быть установлен уже после выздоровления больного.
Чаще всего используют РТГА, иногда РСК, редко — реакцию нейтрализации и реакцию радиального гемолиза.
Для получения достоверного ответа необходимо исследование парных сывороток, первую из них берут в первые дни болезни, вторую — 7—10 дней спустя.
Диагноз считают подтвержденным, если во второй сыворотке обнаруживают не менее чем четырехкратный прирост антител!
Принцип реакции основан на способности AT связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты.
Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток.
Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, MINI, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток
При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГ
Вопрос 39.
Испражнения больного собирают в стерильный флакон троекратно на протяжении первых 3-5 дней заболевания. Для уничтожения многочисленной бактериальной флоры обрабатывают их антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином. Содержащая по 100 ЕД/мл каждого антибиотика в растворе Хенкса) в течение суток при 4 градусах,после чего проводят контрольный высев на стерильность. При отсутствии бактерий суспензию испражнений используют для заражения клеточных структур ,а при сохранении бактериальной флоры повторно обрабатывают теми же антибиотиками. Заражают одновременно по 2-3 пробирки с первичной культурой клеток( фибробластов эмбриона человека или почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток) линии HeLa, амниона человека и др.), посколу одни виды энтеровирусов лучше репродуцируются в первичных, другие- в перевиваемых клетках. Обычно на 2-Зй день после инкубации зараженных клеточных культур при 35 градусах наблюдается полная или частичная дегенерация клеток. При этом интенсивность ЦПД зависит от многих причин: дозы вируса, вида и состояния культуры кйеток и др. В случае слабовыраженного или полного отсутствия ЦПД проводят дополнительно 2-3 пассажа. При отрицательном результате исследование пркращают, при положительном- приступают к идентификации выделенного цитопатогенного агента(вируса). Исследуемый вирус предварительно титруют в той же клеточной культуре. На которой он был выделен. Для реакции нейтрализации берут 100 ЦПД50 данного вируса (за 1 ЦПД50 принимают максимальное разведение вируса, вызывающее дегенерацию не менее 50% клеток культур). Идентификацию энтеровирусов проводят путем серотипирования в реакции нейтрализации в культуре клеток. С этой целью используют смеси диагностических моновалентных сывороток или стандартные поливалентные сыворотки, а затем соответствующие моновалентные сыворотки. Вначале устанавливают принадлежность исследуемого агента к вирусам полиомиелита,Коксаки или ,ЕСНО в реакции нейтрализации с поливалентными сыворотками к каждой из Зх упомянутых групп вирусов. Так,если нейтрализация исследуемого материала произошла с поливалентной сывороткой полиомиелита, то на следующем этапе ставят реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками к каждому серотипу данного вируса.
Вопрос 40.
. Работа в микробиологической лаборатории мед.учреждения проводится с
возбудителями инфекционных заболеваний - патогенными микроорганизмами. Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутреннего распорядка.
Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход без халата категорически воспрещен. В необходимых случаях работающие надевают на лицо маску из марли. Работа с особо опасными микроорганизмами регламентируется специальной инструкцией и проводится в режимных лабораториях.
В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.
при случайном попадании заразного материала на стол, пол и пр.место необходимо тщательно обработать дез.растворомхранение, наблюдение за культурами микроорганизмов и их уничтожение должны производиться согласно специальной инструкции. Все культуры патогенных микроорганизмов регистрируют в спец. журнале.
по окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дез. раствором.
Если произошла авария с разбрызгиванием патогенных биологических агентов:
все находящиеся в помещении лица немедленно прекращают работу и, задержав дыхание, выходят из заразного помещения в предбокс, плотно закрывают дверь, включают аварийную сигнализацию и сообщают о случившемся руководителю подразделения
руки обрабатывают дез раствором или спиртом
слизистые глаза, носа и рта обрабатывают препаратами из аварийной аптечки, рот и горло прополаскиваются 70% этиловым спиртом, в нос закапывают раствор марганцовокислого калия 1:100000 или 1% раствором борной кислоты, а при аварии с вирусами затем закапывают интерферон
защитную одежду снимают, погружают в дез раствор или в бикс для автоклавированияоткрытые части тела протирают 70% этиловым спиртом
в глаза закапывают средства к которым чувствителен возбудитель (антибиотики)
принимают гигиенический душ и одевают чистую одежду.
Вопрос41.
Микроскопировать препарат с использованием иммерсионной системы светового микроскопа.
на приготовленный и окрашенный препарат нанести каплю иммерсионного масла и поместить на предметный столик.
повернуть револьвер до отметки объектива 90.
осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла.
установить ориентировочный фокус при помощи макровинта.
провести окончательную фокусировку препарата микровинтом, вращая его в пределах одного оборота.
по окончании работы вытереть масло с объектив и перевести револьверное устройство на малое увеличение (8)
Вопрос 42.
Приготовить фиксированный препарат из чистой культуры микроорганизмов, окрасить его водным фуксином, микроскопировать и дать характеристику.
Приготовление мазка. На обезжиренное мылом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1—2 см2Высушивание мазка. Лучше сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе или на руке. Тонкий мазок высыхает очень быстро. Можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию проводить осторожно, не перегревая мазка, т.к. клетки микроорганизмов деформируются.
Фиксация-несколько целей: убить микроорганизмы, т. е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации-термическая обработка (препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх). Не перегревать мазок, (грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток).
Окраска.
Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие над кюветой, и заливают красителем на 1—3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя на мазке не подсыхал. В случае необходимости на мазок наливают новые порции красителя. По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 90Х- Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксировать и окрашивать можно также и препараты «отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.
Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий таких, как Serratia marcescens, готовят препарат фиксированных клеток и окрашивают их простым способом.
Вопрос43.
Приготовить фиксированный препарат из чистой культуры микроорганизмов, окрасить его метиленовым синим, микроскопировать и дать характеристику.Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю физ. раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал (его ерут из пробирки с чистой культурой, берут биолог, петлей, предварительно открывая пробирку с культурой в пламени горелки и закрывают ее в пламени горелки) и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированы бактериал>ные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать. Для фиксашн мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим - это простой (3-5 мин ), промыть водой, высушить и микроскопировать. Посмотреть в микроскоп и определить форму микроорганизмов (вопрос 52), в мазге окрасились микроорганизмы в синий шет.
Вопрос44.
Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом ,чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки. Для фиксации мазка предметное стекло(мазком вверх) медленно проводят 3 раза( в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают,плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазкт крови, мазки-отпечатки оргайов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксированные жидкости. Окраска по Граму в модификации А. И. Синева . Заготовляют полоски фильтровальной бумаги, пропитанной 1%ным спиртовым раствором кристаллвиолета и высушенной. На препарат накладывают такую полоску (меньше предметного стекла) и набивают 2—3 капли воды. Окрашивание длится 2 мин, после чего снимают фильтровальную бумагу пинцетом и наливают 3—4 капли раствора Люголя, выдерживая препарат 1 мин. Затем его обесцвечивают спиртом и окрашивают разведенным фуксином з течение 0,5—1 мин. Фуксин сливают, мазок промывают водой и просушивают препарат фильтровальной бумагой
Вопрос45.
Приготовить фиксированный препарат из гноя,окрасить его соответствующим методом, микроскопировать и дать характеристику.
Для препаратов из гноя применяется окраска по Граму или по Цилю-Нельсену.
Окраска по Граму:
1 .На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снимают,краситель сливают. 2.Наносят р-р Люголя на 1-2 мин 3.Обесцвечивают спиртом и быстро смывают водой.
4,Докрашивают мазок водным р-ом фуксина в течение 1-2 мин ,промывают водой, высушивают .микроскопируют.
Окраска по Цилю-Нельсену:
Haфиксированный мазок наносят карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 мин
Снимаютбумагу,промывают мазок водой
Намазок наносят 5%р-р серной к-ты или 3% р-р солянокислого спирта на 1-2 мин для обесцвечивания.Промывают водой.
Докрашиваютводным р-ом метиленового синего в течение 3-5 мин
Вопрос46.
Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю
воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал(испражнения) и распределяют его таким образом ,чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1.5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки.Если исследуемый материал содержится в жидкой среде то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок.Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.Для фиксации мазка предметное стекло(мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки.Микробы при фиксации погибают. Плотно прикрепляясь к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке.Далее окрашивают по Граму.Микроскопируем.
Вопрос 47.
Окрасить фиксированный препарат из мокроты больного с подозрением на туберкулез, микроскопировать, дать характеристику.
Окраска по Цилю-Нильсену:
Намазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску „ фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров 3-5 минут.
Снять бумагу, промыть водой.
Нанести 5% р-р серной кислоты или 3%р-р смеси спирта с НС1 на 1-2 минуты для обесцвечивания.
Промыть водой.
Докрасить водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.
Промыть водой, высушить, микроскопировать.
Вопрос48.
Окрасить готовый препарат водным фуксином, микроскопировать и дать характеристику.
Окраска фуксином относится к простым способам окраски. На препарат наносят несколько капель фуксина, оставляют на 1-2 минуты, затем промывают водой и просушивают. При микроскопии определяют наличие бактерий в препарате, их форму, размеры и взаиморасположение клеток.
Вопрос 49.
Окрасить готовый препарат метиленовым синим, микроскопировать и дать его характеристику.Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим - это простой (3-5 мин.), промыть водой, высушить и микроскопировать. Посмотреть в микроскоп и определить форму микроорганизмов (вопрос 52), в мазке окрасились микроорганизмы в синий цвет.
Вопрос50.
0красить готовый препарат по методу Грама в модификации Синева. Микроскопировать.
Принцип окраски по Граму основан на том, что положительно красящиеся по Граму микробы имеют в клеточной стенке много слоев пептидогликана, состоящего из тейхоевых и липотейхоевых кислот, которые при окрашивании
красками (генцианвиолет, кристаллвиолет) в присутствии йода дают прочные соединения, не разрушающиеся спиртом.
Микробы, отрицательно красящиеся по Граму, в своем составе не имеют таких веществ и потому при окрашивании этими красками в присутствии йода не дают прочных соединений, и при действии спирта обесцвечиваются. Окраска по Граму. Высушивание мазка; фиксация;
1.0краска феноловым генцианвиолетом (карболово-спиртовой раствор) 90 сек - через полоску фильтровальной бумаги (вмодификации Синева используется вместо растворов красителей фильтровальная бумага, заранее пропитанную красителем), сливают...
2.0бработка раствором Люголя (1,0 йода; 2,0 йодистого калия и 300,0 дистиллированной воды) — 60 сек.,
3.Обесцвечивание 70° спиртом до серостального цвета (цвет дыма папиросы) — Смывают Люголь спиртом. 4.Промывание водой;
5.Окрашивание контрастной краской (водным раствором фуксина Пфейфера) в течение 90 сек.;•
б.Обмывание водой;
7.Высушивание фильтровальной бумагой.
Грамположительные микробы красятся в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный.
Вопрос51.
Окрасить готовый препарат по методу Циля-Нильсена, микроскопировать:
На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 мин.
Снимают бумагу, промывают мазок водой.
На мазок наносят 5%раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2мин. для обесцвечивания.
Промывают водой.
Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5мин.
Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Вопрос52.
Дать характеристику бактерий в мазке по форме и окраске.
Для бактерий характерны четыре основные формы сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная. Бактерии шаровидной формы - кокки - в зависимости от плоскости деления и расположения относительно друг друга отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки)липлококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков), сарцины ( пакеты из 8 или 16 кокков). Палочковидные располагаются в виде одиночных клеток, липло- или стрептобактерий. Извитые - вибрионы и спириллы, а так же спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы - извитую форму с несколькими спиральными завитками.
Отношение бактерий к окраске по Граму.
Грамположительные Грам отрицательные
Стафилококки, стрептококки, пневмококки. Гонококки, менингококки, витлонеллы, моракселлы.
Бациллы, клострндии, каринебактерии, микобактерии, бифидобактерии. Большинство палочковидных форм,кромеВсе вибрионы, кампилобактерии, спириллы. Спирохеты.
Актиномицеты Риккетсии, хламидии.
Вопрос53.
Микроскопировать мазок из отделяемого уретры и дать заключение.Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого материала готовят мазки иокрашивают по Граму. В положительном случае обнаруживают коки. Дифференцирование стафилококков, стрептококков и гонококков проводится на основании взаимного расположения клеток, локализации их внутри или вне лейкоцитов, окраски по Граму. Дифференцирование стафилококков, стрептококков и гонококков проводится на основании взаимного расположения клеток, локализации их внутри или вне лейкоцитов, окраски по Граму стафилококки и стрептококки являются грамположительными кокками, которые располагаются, как правило, вне лейкоцитов. Гонококки- грамотрицательные диплококки бобовидной формы(0,96-1 мкм) располагающиеся внутри лейкоцитов. Положительный бактериоскопический диагноз ставится в основном при острой форме гонореи до применения антибиотиков. При хронической форме бактериоскопическое исследование часто дает отрицательный результат.
Вопрос54.
Микроскопировать мазок из осадка ликвора и дать заключение. Ликвор - спинномозговая жидкость. Ликвор берут в количестве 2-5 мл. и делят на две части: одну центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдерживают при температуре 37 для накопления бактерий. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве случаев обнаруживаются типичные, грамотриц. Диплококки, имеющие характерное расположение - внутри лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менингококковой инфекции.
Вопрос 55.
Посев материала от больного на жидкую питательную среду для выделения анаэробных микроорганизмов
Материал от больного вылить в пробирку со средой Китта-Тароцци, перемешать и поверх среды налить тонкий слой вазелина- для создания анаэробных условий.
Вопрос 56.
Произвести посев материала от больного штриховым способом на плотную питательную среду для выделения чистой культуры микроорганизмов.
Чашку Петри с питательной средой делят на 4 сектора. Бактериологической петлей производят посев на 1-й сектор ,после этого петлю прожигают и делают по 4 штриховых посева из 1-го сектора во 2-й и т.д.
Вопрос57.
ПРОИЗВЕСТИ ПОСЕВ ОТ БОЛЬНОГО ПО ДРИГАЛЬСКОМУ НА ПЛОТНУЮ ПИТАТЕЛЬНУЮ СРЕДУ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Используют 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель, не обеззараживая, переносят во 2-ю чашку и втирают оставшиеся на нем микроорганизмы в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на третьей или на второй и третьей чашках вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры.
Вопрос58.
Произвести посев изолированной колонии с чашки Петри с МПА на скошенный агар и среду Олъкеницкого.Среда Олькеницкого является комбинированной. Готовится на основе не очень плотного МПА и содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0.1 %), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Посев проводится штрихом по скошенной части и уколом в столбик.
Для пересева изолированных колоний просматривают чашку Петри и изучают колонии. Прокаливают петлю, открывают чашку, остужая об ^ стенку петлю, и снимают часть колонии, не задевая соседние. Чашку закрывают.
При пересеве на среду Олькеницкого пробирку берут в левую руку, правой вынимают пробку над пламенем горелки. Для посева по скошенной части в пробирку вносят петлю с посевным материалом, опускают ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной части.
При посеве уколом в столбик петлей делают прокол среды с поверхности до дна. Вынув петлю, ожигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив.
Вопрос 59, 60.
Поставить опыт, произвести учёт и оценить результаты определения чувствительности стафилококка к антибиотикам методом стандартных дисков. Метод стандартных дисков (метод диффузии в агар) - наиболее простой и широко применяемый. Это качественный метод, позволяющий определить, к каким антибиотикам чувствителен микроб, выделенный от больного. Испытуемую культуру засевают сплошным газоном на чашку с питательным агаром. Затем на поверхность агара помешают бумажные диски, пропитанные антибиотиками. После суточного инкубирования в термостате измеряют диаметр зон задержки роста вокруг каждого диска и чем больше диаметр, тем исследуемая культура бактерий чувствительнее к антибиотику. А значит именно этот антибиотик будет более действенным при лечении. Определение проводят с чистыми культурами бактерий. Однако в некоторых случаях для быстрого получения ориентировочных результатов используют непосредственно патологический материал. Метод дисков не даст надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирукшим в агар полипептндным антибиотикам (полимнксин, ристомииин) Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений
Вопрос 61.
Учесть результаты определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Метод серийных разведений в жидких средах позволяет установить минимальную ингибируюшую концентрацию (МИК) и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) препарата для выделенного возбудителя.
Данным методом определяют миним концентрацию а/б, ингибируюшую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию а/б в спец растворителе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль кул-ры). Посевы инкубир сутки, отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней миним ингибир концентр (МИК) антибиотика.
Оценку рез-ов проводят по табл. 8.3.(стр 83 руководства).
Вопрос 62.
Постановить реакцию агглютинации на стекле.
Реакция агглютинации на стекле ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в зависимости от ее титра составляет 1:! О, 1:25, 1:50 или 1: 100. Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, а на другую - каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2-4 минут. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютината в каплях. Учет производят через 3-5 минут.

Приложенные файлы

  • docx 19139549
    Размер файла: 82 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий